Modellazione dell'ictus nei topi: occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media attraverso l'arteria carotide esterna
Summary
Diversi modelli di occlusione dell’arteria cerebrale media (MCAo) sono utilizzati nella ricerca sperimentale sull’ictus. Qui, viene descritto un modello sperimentale di ictus di MCAo transitorio attraverso l’arteria carotide esterna (ECA), che mira a imitare l’ictus umano, in cui il trombo cerebrovascolare viene rimosso a causa della lisi spontanea del coagulo o della terapia.
Abstract
L’ictus è la terza causa più comune di mortalità e la principale causa di disabilità acquisita negli adulti nei paesi sviluppati. Ad oggi, le opzioni terapeutiche sono limitate a una piccola percentuale di pazienti con ictus entro le prime ore dopo l’ictus. Nuove strategie terapeutiche sono state ampiamente studiate, soprattutto per prolungare la finestra temporale terapeutica. Queste indagini attuali includono lo studio di importanti percorsi fisiopatologici dopo l’ictus, come l’infiammazione post-ictus, l’angiogenesi, la plasticità neuronale e la rigenerazione. Nell’ultimo decennio, c’è stata una crescente preoccupazione per la scarsa riproducibilità dei risultati sperimentali e dei risultati scientifici tra i gruppi di ricerca indipendenti. Per superare la cosiddetta “crisi della replicazione”, sono urgentemente necessari modelli standardizzati dettagliati per tutte le procedure. Come sforzo all’interno del consorzio di ricerca “ImmunoStroke” (https://immunostroke.de/), viene proposto un modello murino standardizzato di occlusione transitoria dell’arteria cerebrale media (MCAo). Questo modello consente il completo ripristino del flusso sanguigno al momento della rimozione del filamento, simulando la lisi del coagulo terapeutica o spontanea che si verifica in gran parte degli ictus umani. La procedura chirurgica di questo modello di corsa “filamentosa” e gli strumenti per la sua analisi funzionale sono dimostrati nel video di accompagnamento.
Introduction
L’ictus è una delle cause più comuni di morte e disabilità in tutto il mondo. Sebbene ci siano principalmente due forme distinte di ictus, ischemico ed emorragico, l’80-85% di tutti i casi di ictus sono ischemici1. Attualmente, sono disponibili solo due trattamenti per i pazienti con ictus ischemico: trattamento farmacologico con attivatore di plasminogeno tissutale ricombinante (rtPA) o trombectomia meccanica. Tuttavia, a causa della ristretta finestra temporale terapeutica e dei molteplici criteri di esclusione, solo un numero selezionato di pazienti può beneficiare di queste specifiche opzioni di trattamento. Negli ultimi due decenni, la ricerca preclinica e traslazionale sull’ictus si è concentrata sullo studio degli approcci neuroprotettivi. Tuttavia, tutti i composti che hanno raggiunto gli studi clinici non hanno finora mostrato miglioramenti per il paziente2.
Poiché i modelli in vitro non possono riprodurre con precisione tutte le interazioni cerebrali e i meccanismi fisiopatologici dell’ictus, i modelli animali sono cruciali per la ricerca preclinica sull’ictus. Tuttavia, imitare tutti gli aspetti dell’ictus ischemico umano in un singolo modello animale non è fattibile, poiché l’ictus ischemico è una malattia altamente complessa ed eterogenea. Per questo motivo, diversi modelli di ictus ischemico sono stati sviluppati nel tempo in diverse specie. La fototrombosi delle arteriole cerebrali o l’occlusione distale permanente dell’arteria cerebrale media (MCA) sono modelli comunemente usati che inducono lesioni piccole e localmente definite nella neocorteccia3,4. Oltre a questi, il modello di corsa più comunemente usato è probabilmente il cosiddetto “modello a filamento”, in cui si ottiene un’occlusione transitoria di MCA. Questo modello consiste in un’introduzione transitoria di un filamento di sutura all’origine dell’MCA, che porta ad una brusca riduzione del flusso sanguigno cerebrale e al conseguente grande infarto delle regioni cerebrali sottocorticali e corticali5. Sebbene la maggior parte dei modelli di corsa imiti le occlusioni MCA 6, il “modello a filamento” consente una delimitazione precisa del tempo ischemico. La riperfusione mediante rimozione del filamento imita lo scenario clinico umano del ripristino del flusso sanguigno cerebrale dopo la lisi del coagulo spontanea o terapeutica (rtPA o trombectomia meccanica). Ad oggi, sono state descritte diverse modifiche di questo “modello di filamento”. Nell’approccio più comune, descritto per la prima volta da Longa et al. nel 19895,un filamento rivestito di silicio viene introdotto attraverso l’arteria carotide comune (CCA) all’origine dell’MCA7. Sebbene sia un approccio ampiamente utilizzato, questo modello non consente il ripristino completo del flusso sanguigno durante la riperfusione, poiché il CCA viene legato in modo permanente dopo la rimozione del filamento.
Negli ultimi dieci anni, un numero crescente di gruppi di ricerca è stato interessato a modellare l’ictus nei topi utilizzando questo “modello di filamento”. Tuttavia, la notevole variabilità di questo modello e la mancanza di standardizzazione delle procedure sono alcune delle ragioni dell’elevata variabilità e scarsa riproducibilità dei risultati sperimentali e dei risultati scientifici riportati finora2,8. Una potenziale causa dell’attuale “crisi di replicazione”, riferendosi alla bassa riproducibilità tra i laboratori di ricerca, è la volumi di infarto dell’ictus non comparabili tra gruppi di ricerca che utilizzano la stessa metodologia sperimentale9. Infatti, dopo aver condotto il primo studio preclinico randomizzato controllato multicentrico10,siamo stati in grado di confermare che la mancanza di una sufficiente standardizzazione di questo modello sperimentale di ictus e dei successivi parametri di esito sono stati i motivi principali del fallimento della riproducibilità negli studi preclinici tra laboratori indipendenti11 . Queste drastiche differenze nelle dimensioni dell’infarto risultanti, nonostante l’utilizzo dello stesso modello di corsa, rappresentano giustamente non solo una minaccia per la ricerca di conferma, ma anche per le collaborazioni scientifiche a causa della mancanza di modelli robusti e riproducibili.
Alla luce di queste sfide, abbiamo mirato a sviluppare e descrivere in dettaglio la procedura per un modello MCAo transitorio standardizzato utilizzato per gli sforzi di ricerca collaborativa all’interno del consorzio di ricerca “ImmunoStroke” (https://immunostroke.de/). Questo consorzio mira a comprendere le interazioni cervello-immunità alla base dei principi meccanicistici del recupero dell’ictus. Inoltre, vengono presentati metodi istologici e funzionali correlati per l’analisi dei risultati dell’ictus. Tutti i metodi si basano su procedure operative standard stabilite utilizzate in tutti i laboratori di ricerca del consorzio ImmunoStroke.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente protocollo descrive un modello sperimentale di ictus basato sull’accordo di consenso di un consorzio di ricerca multicentrico tedesco (“ImmunoStroke”) per stabilire un modello MCAo transitorio standardizzato. Il modello MCAo transitorio stabilito introducendo un filamento rivestito di silicio attraverso l’ECA all’origine dell’MCA è uno dei modelli di ictus più utilizzati per ottenere la riperfusione arteriosa dopo un periodo di occlusione delimitato. Pertanto, questa procedura può essere considerata un mod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo tutti i nostri partner di collaborazione dei Consorzi ImmunoStroke (FOR 2879, Dalle cellule immunitarie al recupero dell’ictus) per suggerimenti e discussioni. Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) nell’ambito della strategia di eccellenza della Germania nell’ambito del Cluster for Systems Neurology di Monaco (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) e nell’ambito delle sovvenzioni LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 e LL-112/1-1.
Materials
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
References
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