Pinzas ópticas para estudiar las interacciones ARN-proteína en la regulación de la traducción
Summary
Este protocolo presenta un flujo de trabajo experimental completo para estudiar las interacciones ARN-proteína utilizando pinzas ópticas. Se describen varias configuraciones experimentales posibles, incluida la combinación de pinzas ópticas con microscopía confocal.
Abstract
El ARN adopta diversos pliegues estructurales, que son esenciales para sus funciones y, por lo tanto, pueden afectar diversos procesos en la célula. Además, la estructura y función de un ARN puede ser modulada por diversos factores de acción trans, como proteínas, metabolitos u otros ARN. Las moléculas de ARN que cambian el marco, por ejemplo, son ARN reguladores ubicados en regiones codificantes, que dirigen la traducción de ribosomas en un marco de lectura abierto alternativo y, por lo tanto, actúan como interruptores genéticos. También pueden adoptar diferentes pliegues después de unirse a proteínas u otros factores trans. Para diseccionar el papel de las proteínas de unión al ARN en la traducción y cómo modulan la estructura y la estabilidad del ARN, es crucial estudiar la interacción y las características mecánicas de estos complejos ARN-proteína simultáneamente. Este trabajo ilustra cómo emplear pinzas ópticas acopladas a fluorescencia de una sola molécula para explorar el panorama conformacional y termodinámico de los complejos ARN-proteína a una alta resolución. A modo de ejemplo, se elabora la interacción del elemento de desplazamiento de marco ribosómico programado por sarS-CoV-2 con la isoforma corta del factor de acción trans de la proteína antiviral zinc-dedo. Además, los ribosomas marcados con fluorescencia se monitorizaron utilizando la unidad confocal, lo que en última instancia permitiría el estudio del alargamiento de la traducción. El ensayo OT acoplado a fluorescencia se puede aplicar ampliamente para explorar diversos complejos de ARN-proteína o factores de acción trans que regulan la traducción y podría facilitar los estudios de regulación génica basada en ARN.
Introduction
La transferencia de información genética del ADN a las proteínas a través de los ARNm es un proceso bioquímico complejo, que se regula con precisión en todos los niveles a través de interacciones macromoleculares dentro de las células. Para la regulación traslacional, las interacciones ARN-proteína confieren un papel crítico para reaccionar rápidamente a diversos estímulos y señales1,2. Algunas interacciones ARN-proteína afectan la estabilidad del ARNm y, por lo tanto, alteran el tiempo que un ARN está activo traslacionalmente. Otras interacciones ARN-proteína se asocian con mecanismos de recodificación como la lectura stop-codón, la derivación o el frameshifting ribosómico programado (PRF)3,4,5,6,7. Recientemente, se ha demostrado que una serie de proteínas de unión al ARN (RBPs) interactúan con elementos estimulantes de ARNm y la maquinaria de traducción para dictar cuándo y cuánta recodificación ocurrirá en la célula7,8,9,10,11. Por lo tanto, para diseccionar el papel de las proteínas de unión al ARN en la traducción y cómo modulan la estructura y la estabilidad del ARN, es fundamental estudiar en detalle los principios de interacción y las propiedades mecánicas de estos complejos ARN-proteína.
Décadas de trabajo han sentado las bases para estudiar el proceso de traducción de múltiples pasos y múltiples componentes, que se basa en la intrincada comunicación entre los componentes de ARN y proteína de la maquinaria de traducción para lograr velocidad y precisión12,13,14. Un siguiente paso crucial en la comprensión de eventos regulatorios complejos es determinar las fuerzas, escalas de tiempo y determinantes estructurales durante la traducción con alta precisión12,15,16,17. El estudio de la dinámica conformacional del ARN y especialmente cómo actúan los factores auxiliares de acción transactuante sobre la estructura del ARN durante la traducción se han iluminado aún más con la aparición de herramientas de una sola molécula, incluidas las pinzas ópticas o las guías de onda de modo cero16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
Las pinzas ópticas (OT) representan una técnica de molécula única de alta precisión, que se ha aplicado para estudiar muchos tipos de procesos dinámicos dependientes del ARN, incluida la transcripción y la traducción26,27,28,29,30,31,32. El uso de pinzas ópticas ha permitido sondear las interacciones moleculares, las estructuras de ácidos nucleicos y las propiedades termodinámicas, cinéticas y energéticas de estos procesos en detalle16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . El ensayo de pinzas ópticas se basa en el atrapamiento de objetos microscópicos con un rayo láser enfocado. En un experimento típico de OT, la molécula de interés está atada entre dos perlas transparentes (generalmente poliestireno) (Figura 1A)27. Estas cuentas son atrapadas por trampas ópticas, que se comportan como resortes. Por lo tanto, la fuerza aplicada sobre la molécula se puede calcular en función del desplazamiento de la perla desde el centro del rayo láser enfocado (centro de trampa). Recientemente, las pinzas ópticas se han combinado con microscopía confocal (Figura 1B), lo que permite mediciones de fluorescencia o transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET)40,41,42. Esto abre un nuevo campo de posibles experimentos que permiten la medición simultánea y, por lo tanto, la correlación precisa de la espectroscopia de fuerza y los datos de fluorescencia.
Aquí, demostramos experimentos utilizando las pinzas ópticas combinadas con microscopía confocal para estudiar las interacciones proteína-ARN que regulan el desplazamiento de marco traslacional. Entre el objetivo y el condensador, una celda de flujo con cinco canales permite la aplicación continua de muestras con flujo laminar. A través de los canales microfluídicos, se pueden inyectar varios componentes directamente, lo que disminuye el tiempo de práctica y permite un consumo de muestras muy pequeño durante todo el experimento.
Primero, se propone una guía básica para ayudar al diseño de experimentos de OT y se discuten las ventajas y las trampas de varias configuraciones. A continuación, se describe la preparación de muestras y flujos de trabajo experimentales, y se proporciona un protocolo para el análisis de datos. Para poner un ejemplo, esbozamos los resultados obtenidos de los experimentos de estiramiento de ARN para estudiar el elemento arn de desplazamiento de marco SARS-CoV-2 (Figura 2A) con el factor de transacción la isoforma corta de la proteína antiviral del dedo de zinc (ZAP), que altera la traducción del ARN viral a partir de un marco de lectura alternativo43. Además, está demostrado que los ribosomas marcados con fluorescencia se pueden emplear en este ensayo confocal OT, lo que sería útil para controlar la procesividad y la velocidad de la maquinaria de traducción. El método presentado aquí se puede utilizar para probar rápidamente el efecto de diferentes tampones, ligandos u otros componentes celulares para estudiar varios aspectos de la traducción. Finalmente, se discuten las trampas experimentales comunes y cómo solucionarlas. A continuación, se describen algunos puntos cruciales en el diseño experimental.
Diseño de construcción
En principio, hay dos enfoques comunes para crear una construcción de ARN compatible con OT. El primer enfoque emplea una molécula larga de ARN que se hibrida con mangos de ADN complementarios, lo que produce una construcción que consiste en dos regiones híbridas de ARN / ADN que flanquean una secuencia de ARN de cadena simple en el medio (Figura 2B). Este enfoque se emplea en la mayoría de los experimentos de ARN OT33,44,45.
El segundo enfoque aprovecha los mangos dsDNA con voladizos cortos (alrededor de 20 nt)15,17. Estos voladizos se hibridan con la molécula de ARN. Aunque es más complicado en el diseño, el uso de mangos dsDNA supera algunas de las limitaciones del sistema híbrido ADN/ARN. En principio, incluso se pueden implementar mangos muy largos (>10kb), lo que es más conveniente para mediciones confocales. Además, la molécula de ARN se puede ligar a los mangos de ADN para aumentar la estabilidad de la correa.
Estrategia de etiquetado final
La construcción debe estar atada a cuentas a través de una fuerte interacción molecular. Si bien existen enfoques disponibles para la unión covalente de mangos a perlas46, las interacciones fuertes pero no covalentes como la estreptavidina-biotina y el anticuerpo digoxigenina se utilizan comúnmente en experimentos de OT15,33,35,45. En el protocolo descrito, el constructo está marcado con biotina o digoxigenina, y las perlas están recubiertas con estreptavidina o anticuerpos contra digoxigenina, respectivamente (Figura 1A). Este enfoque sería adecuado para aplicar fuerzas de hasta aproximadamente 60 pN (por correa)47. Además, el uso de diferentes estrategias de etiquetado de 5′ y 3′ permite determinar la orientación de la correa formada entre las cuentas17.
Etiquetado de proteínas para mediciones de fluorescencia
Para las imágenes confocales, hay varios enfoques comúnmente utilizados para el etiquetado de fluorescencia. Por ejemplo, los fluoróforos pueden unirse covalentemente a residuos de aminoácidos que se encuentran de forma nativa en las proteínas o se introducen por mutagénesis dirigida al sitio a través de un grupo orgánico reactivo. Los colorantes reactivos al tiol o amina se pueden utilizar para el etiquetado de residuos de cisteína y lisina, respectivamente. Existen varios métodos de protección reversibles para aumentar la especificidad del etiquetado48,49, sin embargo, las proteínas nativas normalmente se etiquetarían en múltiples residuos. Aunque el pequeño tamaño del fluoróforo puede conferir una ventaja, el etiquetado no específico puede interferir con la actividad de la proteína y, por lo tanto, la intensidad de la señal puede variar49. Además, dependiendo de la eficiencia del etiquetado, la intensidad de la señal puede diferir entre diferentes experimentos. Por lo tanto, se debe realizar una verificación de actividad antes del experimento.
En caso de que la proteína de interés contenga una etiqueta N- o C-terminal, como una etiqueta His o una etiqueta estreptocócica, el etiquetado específico de estas etiquetas representa otro enfoque popular. Además, el etiquetado dirigido a etiquetas reduce la posibilidad de que el fluoróforo interfiera con la actividad de las proteínas y puede mejorar la solubilidad49. Sin embargo, el etiquetado específico de la etiqueta generalmente produce proteínas marcadas con monofluoróforos, que podrían ser difíciles de detectar. Otra forma de etiquetado específico se puede lograr mediante el empleo de anticuerpos.
Configuración de microfluidos
La combinación de OT con un sistema de microfluídica permite una transición rápida entre diferentes condiciones experimentales. Además, los sistemas actuales aprovechan el mantenimiento del flujo laminar dentro de la celda de flujo, lo que impide la mezcla de líquidos de otros canales en la dirección perpendicular en relación con la dirección del flujo. Por lo tanto, el flujo laminar es particularmente ventajoso para el diseño experimental. Actualmente, las celdas de flujo con hasta 5 canales se emplean comúnmente (Figura 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, demostramos el uso de pinzas ópticas acopladas a fluorescencia para estudiar las interacciones y el comportamiento dinámico de las moléculas de ARN con varios ligandos. A continuación, se discuten los pasos críticos y las limitaciones de la presente técnica.
Pasos críticos en el protocolo
Como para muchos otros métodos, la calidad de la muestra es fundamental para obtener datos confiables. Por lo tanto, para obtener muestras de la más alta calidad posible, v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Anuja Kibe y al Prof. Redmond Smyth por revisar críticamente el manuscrito. Agradecemos a Tatyana Koch por la asistencia técnica experta. Agradecemos a Kristyna Pekarkova por la ayuda con la grabación de videos experimentales. El trabajo en nuestro laboratorio cuenta con el apoyo de la Asociación Helmholtz y la financiación de la subvención nr. 948636 (a NC) del Consejo Europeo de Investigación (ERC).
Materials
| Bacterial Strains | |||
| E. coli HB101 | lab collection | N/A | cloning of the vectors |
| Chemicals and enzymes | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 31424 | Buffers |
| Biotin-16-dUTP | Roche | 11093070910 | Biotinylation |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4737 | Buffers |
| Catalase | Lumicks | N/A | Oxygen scavanger system |
| Dithiothreitol (DTT) | Melford Labs | D11000 | Buffers |
| DNAse I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4527 | in vitro transcription |
| dNTPs | Th.Geyer | 11786181 | PCR |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Buffers |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 11814320001 | Buffers |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | Oxygen scavanger system |
| Glucose-oxidase | Lumicks | N/A | Oxygen scavanger system |
| HEPES | Carl Roth | HN78.3 | Buffers |
| Magnesium chloride | Carl Roth | 2189.1 | Buffers |
| Phusion DNA polymerase | NEB | M0530L | Gibson assembly, cloning |
| Potassium chloride | Merck | 529552-1KG | Buffers |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | Takara Bio Clontech | R050A | PCR |
| Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic | NEB | M0296L | in vitro transcription |
| RNase Inhibitor | Molox | 1000379515 | Buffers |
| rNTPS | life technologies | R0481 | in vitro transcription |
| Sodium thiosulophate | Sigma-Aldrich | S6672-500G | Bleach deactivation |
| Sytox Green | Lumicks | N/A | confocal measurements |
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | Biotinylation |
| T5 exonuclease | NEB | M0363S | Gibson assembly, cloning |
| T7 RNA polymerase | Produced in-house | N/A | in vitro transcription |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0267S | PCR |
| Taq ligase | Biozym | L6060L | Gibson assembly, cloning |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P7949 | Buffers |
| Kits | |||
| Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) | Nanotemper | MO-L011 | Used for ribosome labeling |
| Purefrex 2.0 | GeneFrontier | PF201-0.25-EX | Ribosomes used for the labeling |
| Oligonucleotides | |||
| 5' handle T7 forward | Microsynth | custom order | 5’ – CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC – 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1 |
| 3’ handle reverse | Microsynth | custom order | 5' - GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1 |
| 5' handle forward | Microsynth | custom order | 5' – TCCTTTCTGTGGACGCCGC – 3' , used to generate 5' handle in PCR 2 |
| 5’ handle reverse | Microsynth | custom order | 5’ – CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT – 3’, used to generate 5' handle in PCR 2 |
| 3’ handle forward | Microsynth | custom order | 5' – ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG – 3', used to generate 3' handle in PCR 3 |
| 3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin | Microsynth | custom order | 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate 3' handle in PCR 3 |
| DNA vectors | |||
| pMZ_OT | produced in-house | N/A | further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control" Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035 |
| Software and Algorithms | |||
| Atom | https://atom.io/packages/ide-python | N/A | |
| Bluelake | Lumicks | N/A | |
| Graphpad | https://www.graphpad.com/ | N/A | |
| InkScape 0.92.3 | https://inkscape.org/ | N/A | |
| Matlab | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | N/A | |
| POTATO | https://github.com/lpekarek/POTATO.git | N/A | |
| RNAstructure | https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html | N/A | |
| Spyder | https://www.spyder-ide.org/ | N/A | |
| 기타 | |||
| Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v | Spherotech | SVP-15-5 | |
| Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v | Spherotech | DIGP-20-2 | |
| Syringes | VWR | TERUMO SS+03L1 | |
| Devices | |||
| C-trap | Lumicks | N/A | optical tweezers coupled with confocal microscopy |
References
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