Técnicas de manuseio para reduzir o estresse em camundongos
Summary
Este artigo descreve uma técnica de manuseio em camundongos, a técnica de manuseio 3D, que facilita o manuseio rotineiro reduzindo comportamentos semelhantes à ansiedade e apresenta detalhes sobre duas técnicas relacionadas existentes (manuseio de túneis e caudas).
Abstract
Animais de laboratório são submetidos a múltiplas manipulações por cientistas ou prestadores de cuidados com animais. O estresse que isso causa pode ter efeitos profundos no bem-estar animal e também pode ser um fator de confusão para variáveis experimentais, como medidas de ansiedade. Ao longo dos anos, técnicas de manuseio que minimizam o estresse relacionado ao manuseio foram desenvolvidas com um foco especial em ratos, e pouca atenção aos ratos. No entanto, foi demonstrado que os ratos podem ser habituados a manipulações usando técnicas de manuseio. Habituar camundongos ao manuseio reduz o estresse, facilita o manuseio de rotina, melhora o bem-estar animal, diminui a variabilidade dos dados e melhora a confiabilidade experimental. Apesar dos efeitos benéficos do manuseio, a abordagem de captação de cauda, que é particularmente estressante, ainda é amplamente utilizada. Este artigo fornece uma descrição detalhada e demonstração de uma técnica recém-desenvolvida de manuseio de camundongos destinada a minimizar o estresse experimentado pelo animal durante a interação humana. Esta técnica manual é realizada ao longo de 3 dias (técnica de manuseio 3D) e foca na capacidade do animal de habituar ao experimentador. Este estudo também mostra o efeito das técnicas previamente estabelecidas de manuseio de túneis (usando um túnel de policarbonato) e da técnica de captação de cauda. Especificamente estudados são seus efeitos sobre comportamentos semelhantes à ansiedade, usando testes comportamentais (Elevated-Plus Maze e Novelty Suppressed Feeding), interação voluntária com experimentadores e medição fisiológica (níveis de corticosterona). A técnica de manuseio 3D e a técnica de manuseio do túnel reduziram fenótipos semelhantes à ansiedade. No primeiro experimento, usando camundongos machos de 6 meses de idade, a técnica de manuseio 3D melhorou significativamente a interação dos experimentadores. No segundo experimento, usando fêmea de 2,5 meses, reduziu os níveis de corticosterona. Como tal, o manuseio 3D é uma abordagem útil em cenários onde a interação com o experimentador é necessária ou preferida, ou onde o manuseio do túnel pode não ser possível durante o experimento.
Introduction
Camundongos e ratos são ativos essenciais para estudos pré-clínicos1,2 para múltiplos fins, incluindo estudos endocrinas, fisiológicos, farmacológicos ou comportamentais2. A partir do crescente número de estudos envolvendo animais, surgiu que variáveis ambientais descontroladas, incluindo a interação humana, influenciam vários desfechos em pesquisas biomédicas3,4,5. Isso é responsável pela variabilidade significativa observada em experimentos e laboratórios de pesquisa4,5, representando uma grande ressalva na pesquisa animal.
Várias abordagens foram implementadas com o objetivo de limitar o impacto dos estressores ambientais e reduzir a reatividade à interação humana. Por exemplo, para limitar o impacto dos estressores ambientais, a padronização das condições de habitação e os sistemas de habitação automatizados6,7 foram implementados em laboratórios. Quanto à interação com os seres humanos, abordagens comumente utilizadas para o manuseio e transporte de animais tinham pouca consideração pelo desconforto e estresse animal. Por exemplo, pegar animais pela cauda ou usar fórceps8 aumenta a ansiedade da linha de base9,10,11, reduz a exploração9,12 e contribui muito para a variabilidade inter-individual dentro e entre os estudos13,14. Como resultado, outras abordagens foram desenvolvidas, como a técnica de manuseio de copos, que é aplicável a ratos e ratos. Nesta abordagem, os animais são “acotosados” para fora de sua gaiola, e mantidos pelos experimentadores com as mãos formando um copo9,10,11. Outra alternativa útil ao manuseio da cauda envolve o uso de um túnel de policarbonato para transferir camundongos9,10,15. Esta abordagem elimina a interação direta entre o mouse e o experimentador. Tanto as abordagens do copo quanto do túnel mostraram eficácia na redução de comportamentos semelhantes à ansiedade e medo do experimentador que pode ser exagerado por técnicas de manuseio aversivo, como o manuseio da cauda9,10.
Portanto, o aumento das evidências demonstra a utilidade do manejo adequado do camundongo para reduzir a variabilidade entre os indivíduos9,11e melhorar o bem-estar animal10. No entanto, as técnicas mencionadas acima ainda enfrentam limitações. A técnica de manuseio do copo foi implementada com horários que variam de 10 dias (10 sessões ao longo de 2 semanas16) até 15 semanas17, o que é uma quantidade considerável de tempo para funcionários e experimentadores de instalações. Além disso, a eficácia do manuseio do copo varia de acordo com a tensão9 e o manuseio convencional do copo em mãos abertas pode levar a ratos ingênuos ou particularmente cepas saltitantes para saltar da mão9,18. O manuseio do túnel resulta em resultados mais consistentes e geralmente mais rápidos na gentling19. Túneis também são usados como enriquecimento de gaiolas domésticas. Eles ajudam os animais a se habituarem a manusear rapidamente e fornecem os benefícios adicionais do enriquecimento. O manuseio do túnel, no entanto, tem limitações na transferência de animais entre aparelhos. Curiosamente, Hurst e West9, e Henderson et al.20 demonstraram que o uso de manuseio manual suave e breve para transferir animais do túnel para o aparelho não afeta seu fenótipo.
Para fornecer uma alternativa aos métodos existentes, com habitação alcançável em um curto período de tempo, este artigo descreve uma nova técnica que se expande na técnica de manuseio do copo, não necessitando, portanto, de nenhum equipamento específico. Esta abordagem usa marcos para medir o nível de conforto que os ratos têm com o processo de manuseio. Mostra eficácia na diminuição da reatividade e estresse do camundongo (nos níveis comportamental e hormonal), facilita o manuseio rotineiro e contribui para reduzir a variabilidade entre os animais. Detalhes dessa técnica são fornecidos aqui, e sua eficácia na redução de comportamentos semelhantes à ansiedade, melhorando a interação com experimentadores e limitando a liberação periférica de hormônio do estresse (corticosterona) são demonstradas em dois estudos separados (camundongos masculinos e femininos), em comparação com técnicas de manuseio de túneis (controle positivo) e controle de cauda (controle negativo).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudo e o desenvolvimento de métodos baseiam-se na observação de que as técnicas de manuseio em camundongos ainda são negligenciadas pela comunidade científica, e que alguns laboratórios ainda estão relutantes em implementar técnicas de habitação ou manuseio para reduzir o estresse e a reatividade de seus animais antes dos experimentos. Ao mesmo tempo em que representa um compromisso de tempo, o manejo animal proporciona efeitos benéficos aos animais que podem contribuir para o sucesso dos experimentos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Comitê de Cuidados Com Animais da CAMH por apoiar este trabalho, bem como aos cuidadores de animais do CAMH que forneceram amplo feedback sobre a utilidade do procedimento, motivando a execução dos experimentos descritos e a apresentação do protocolo detalhado para outros usuários. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo CAMH BreakThrough Challenge, concedido ao TP, e por fundos internos da CAMH.
Materials
| 23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel. | BD | 2546-CABD305145 | Needles for Blood collection |
| BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk | BD | 367841 | EDTA Coated tubes for blood collection |
| Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding | Bed-O-Cobs | BEDO1/4 | Novel bedding for novelty suppressed feeding |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5424 R | For centrifugation of blood. |
| Corticosterone ELISA Kit | Arbor Assays | K003-H1W | |
| Digital Camera | Panasonic | HC-V770 | Camera to record EPM/Experimenter interactions |
| Elevated Plus Maze | Home Made | n/a | Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor |
| Ethanol | Medstore House Brand | 39753-P016-EA95 | Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning |
| Ethovision XT 15 | Noldus | n/a | Automated animal tracking software |
| Laboratory Rodent Diet | LabDiet | Rodent Diet 5001 | Standard Rodent diet |
| Memory Card | Kingstone Technology | SDA3/64GB | For video recording and file transfer |
| Novelty Suppressed Feeding Chamber | Home Made | n/a | Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall . |
| Parlycarbonate tubes | Home Made | n/a | 13 cm in length and 5cm in diameter |
| Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding | Purina | n/a | Standard Bedding |
| Spectrophotometer | Biotek | Epoch Microplate Reader |
References
- Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936 (2006).
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Martic-Kehl, M., Ametamey, S., Alf, M., Schubiger, P., Honer, M. Impact of inherent variability and experimental parameters on the reliability of small animal PET data. EJNMMI Research. 2 (1), 26 (2012).
- Howard, B. R. Control of Variability. ILAR Journal. 43 (4), 194-201 (2002).
- Toth, L. A. The influence of the cage environment on rodent physiology and behavior: Implications for reproducibility of pre-clinical rodent research. Experimental Neurology. 270, 72-77 (2015).
- Golini, E., et al. A Non-invasive Digital Biomarker for the Detection of Rest Disturbances in the SOD1G93A Mouse Model of ALS. Frontiers in Neuroscience. 14 (896), (2020).
- Singh, S., Bermudez-Contreras, E., Nazari, M., Sutherland, R. J., Mohajerani, M. H. Low-cost solution for rodent home-cage behaviour monitoring. PLoS One. 14 (8), 0220751 (2019).
- Stewart, K., Schroeder, V. A. Rodent Handling and Restraint Techniques. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
- Gouveia, K., Hurst, J. L. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Scientific Reports. 9 (1), 20305 (2019).
- Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999 (2017).
- Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
- Wahlsten, D., et al. Different data from different labs: lessons from studies of gene-environment interaction. Journal of Neurobiology. 54 (1), 283-311 (2003).
- Nature Neuroscience. Troublesome variability in mouse studies. Nature Neuroscience. 12 (9), 1075 (2009).
- Sensini, F., et al. The impact of handling technique and handling frequency on laboratory mouse welfare is sex-specific. Scientific Reports. 10 (1), 17281 (2020).
- Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
- Novak, J., Bailoo, J. D., Melotti, L., Rommen, J., Würbel, H. An Exploration Based Cognitive Bias Test for Mice: Effects of Handling Method and Stereotypic Behaviour. PLoS One. 10 (7), 0130718 (2015).
- Gouveia, K., Waters, J., Hurst, J. L. Mouse Handling Tutorial. NC3Rs. , (2016).
- Gouveia, K., Hurst, J. L. Reducing Mouse Anxiety during Handling: Effect of Experience with Handling Tunnels. PLoS One. 8 (6), 66401 (2013).
- Henderson, L. J., Smulders, T. V., Roughan, J. V. Identifying obstacles preventing the uptake of tunnel handling methods for laboratory mice: An international thematic survey. PLoS One. 15 (4), 0231454 (2020).
- Percie Du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLOS Biology. 18 (7), 3000410 (2020).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
- Guilloux, J. P., Seney, M., Edgar, N., Sibille, E. Integrated behavioral z-scoring increases the sensitivity and reliability of behavioral phenotyping in mice: relevance to emotionality and sex. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 21-31 (2011).
- LaFollette, M. R., et al. Laboratory Animal Welfare Meets Human Welfare: A Cross-Sectional Study of Professional Quality of Life, Including Compassion Fatigue in Laboratory Animal Personnel. Frontiers in Veterinary Science. 7 (114), (2020).
- Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
- Bailoo, J. D., et al. Effects of Cage Enrichment on Behavior, Welfare and Outcome Variability in Female Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, (2018).
- Spangenberg, E. M., Keeling, L. J. Assessing the welfare of laboratory mice in their home environment using animal-based measures – a benchmarking tool. Laboratory Animals. 50 (1), 30-38 (2016).
- Theil, J. H., et al. The epidemiology of fighting in group-housed laboratory mice. Scientific Reports. 10 (1), 16649 (2020).
- Weber, E. M., Dallaire, J. A., Gaskill, B. N., Pritchett-Corning, K. R., Garner, J. P. Aggression in group-housed laboratory mice: why can’t we solve the problem. Lab Animal. 46 (4), 157-161 (2017).
- Cloutier, S., Baker, C., Wahl, K., Panksepp, J., Newberry, R. C. Playful handling as social enrichment for individually- and group-housed laboratory rats. Applied Animal Behaviour Science. 143 (2), 85-95 (2013).
- Panksepp, J., Burgdorf, J. 50-kHz chirping (laughter?) in response to conditioned and unconditioned tickle-induced reward in rats: effects of social housing and genetic variables. Behavioural Brain Research. 115 (1), 25-38 (2000).
