Методы управления для снижения стресса у мышей
Summary
В этой статье описывается техника обработки у мышей, техника 3D-обработки, которая облегчает рутинную обработку за счет снижения тревожного поведения, и представлены подробности о двух существующих связанных методах (туннельная и хвостовая обработка).
Abstract
Лабораторные животные подвергаются многочисленным манипуляциям со стороны ученых или поставщиков услуг по уходу за животными. Стресс, который это вызывает, может оказать глубокое влияние на благополучие животных, а также может быть смешанным фактором для экспериментальных переменных, таких как меры тревоги. На протяжении многих лет были разработаны методы обработки, которые минимизируют стресс, связанный с обращением, с особым акцентом на крысах и небольшим вниманием к мышам. Тем не менее, было показано, что мыши могут привыкнуть к манипуляциям с использованием методов обработки. Привыкание мышей к обращению снижает стресс, облегчает рутинное обращение, улучшает самочувствие животных, уменьшает изменчивость данных и повышает надежность экспериментов. Несмотря на благотворное влияние обработки, подход хвостового подъема, который является особенно стрессовым, по-прежнему широко используется. В этой статье представлено подробное описание и демонстрация недавно разработанной техники обработки мышей, предназначенной для минимизации стресса, испытываемого животным во время взаимодействия с человеком. Эта ручная техника выполняется в течение 3 дней (техника 3D-обработки) и фокусируется на способности животного привыкать к экспериментатору. Это исследование также показывает влияние ранее установленных методов обработки туннелей (с использованием поликарбонатного туннеля) и метода подъема хвоста. В частности, изучаются их влияние на тревожное поведение с использованием поведенческих тестов (Elevated-Plus Maze и Novelty Suppressed Feeding), добровольного взаимодействия с экспериментаторами и физиологических измерений (уровни кортикостерона). Техника 3D-обработки и техника обработки туннелей уменьшали фенотипы, подобные тревоге. В первом эксперименте с использованием 6-месячных самцов мышей техника 3D-обработки значительно улучшила взаимодействие экспериментаторов. Во втором эксперименте, используя 2,5-месячную самку, он снижал уровень кортикостерона. Таким образом, 3D-обработка является полезным подходом в сценариях, где взаимодействие с экспериментатором требуется или предпочтительно, или где обработка туннеля может быть невозможна во время эксперимента.
Introduction
Мыши и крысы являются важными активами доклинических исследований1,2 для различных целей, включая эндокринные, физиологические, фармакологические или поведенческие исследования2. Из увеличения числа исследований с участием животных выяснилось, что неконтролируемые переменные окружающей среды, включая взаимодействие с человеком, влияют на различные результаты в биомедицинских исследованиях3,4,5. Это отвечает за значительную изменчивость, наблюдаемую в экспериментах и исследовательских лабораториях4,5,что представляет собой серьезную оговорку в исследованиях на животных.
Были реализованы различные подходы с целью ограничения воздействия экологических стрессоров и снижения реактивности к взаимодействию с человеком. Например, для ограничения воздействия экологических стрессоров в лабораториях внедрена стандартизация жилищных условий и автоматизированные жилищные системы6,7. Что касается взаимодействия с людьми, то широко используемые подходы к обращению с животными и их транспортировке мало внимания относятся к дискомфорту и стрессу животных. Например, взятие животных за хвост или использование щипцов8 увеличивает базовую тревогу9,10,11,уменьшает исследование9,12 и в значительной степени способствует межибытовой изменчивости в исследованиях13,14и между них. В результате были разработаны другие подходы, такие как техника обработки чашек, которая применима к мышам и крысам. При таком подходе животных «вытаскивают» из клетки, и экспериментаторы держат руками, образуя чашку9,10,11. Другая полезная альтернатива обработке хвоста включает в себя использование поликарбонатного туннеля для переноса мышей9,10,15. Такой подход исключает прямое взаимодействие между мышью и экспериментатором. Как чашечная, так и туннельная подходы показали эффективность в снижении тревожного поведения и страха перед экспериментатором, которые могут быть преувеличены отвратительными методами обработки, такими как подъем хвоста / обработка хвоста9,10.
Таким образом, растущее количество доказательств демонстрирует полезность правильного обращения с мышами для снижения изменчивости между особями9,11и улучшения благосостояния животных10. Однако методы, упомянутые выше, по-прежнему сталкиваются с ограничениями. Техника обработки чашек была реализована с графиками от 10 дней (10 сеансов в течение 2 недель16)до 15 недель17,что является значительным количеством времени для персонала объекта и экспериментаторов. Кроме того, эффективность работы с чашками варьируется в зависимости от штамма9, а обычное обращение с чашками в открытых руках может привести к тому, что наивные мыши или особенно прыгучие штаммы прыгают с руки9,18. Обработка туннелей приводит к более последовательным и, как правило, более быстрым результатам в19. Туннели также используются в качестве обогащения домашних клеток. Они помогают животным быстро привыкнуть к обращению и обеспечивают дополнительные преимущества обогащения. Однако обработка туннелей имеет ограничения при перевозке животных между аппаратами. Интересно, что Hurst and West9и Henderson et al.20 продемонстрировали, что использование мягкого и краткого ручного обращения для переноса животных из туннеля в аппарат не влияет на их фенотип.
Чтобы обеспечить альтернативу существующим методам с достижимым привыканием за короткий период времени, в этой статье описывается новая техника, которая расширяет технику обработки чашек, поэтому не требует какого-либо конкретного оборудования. Этот подход использует вехи для оценки уровня комфорта мышей в процессе обработки. Он показывает эффективность в снижении реактивности и стресса мышей (на поведенческом и гормональном уровнях), облегчает рутинное обращение и способствует снижению изменчивости между животными. Подробности этого метода приведены здесь, а его эффективность в снижении тревожного поведения, улучшении взаимодействия с экспериментаторами и ограничении высвобождения периферического гормона стресса (кортикостерона) продемонстрирована в двух отдельных исследованиях (самцы и самки мышей) по сравнению с туннельной обработкой (положительный контроль) и методами обращения с хвостом (отрицательный контроль).
Protocol
Representative Results
Discussion
Это исследование и разработка метода основаны на наблюдении, что методы обработки на мышах все еще упускаются из виду научным сообществом, и что некоторые лаборатории по-прежнему неохотно внедряют методы привыкания или обработки для снижения стресса и реактивности своих животных до э…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Комитет по уходу за животными CAMH за поддержку этой работы, а также лиц, осуществляющих уход за животными CAMH, которые предоставили обширную обратную связь о полезности процедуры, мотивируя выполнение описанных экспериментов и представление подробного протокола для других пользователей. Эта работа была частично профинансирована CAMH BreakThrough Challenge, присужденной TP, и внутренними фондами CAMH.
Materials
| 23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel. | BD | 2546-CABD305145 | Needles for Blood collection |
| BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk | BD | 367841 | EDTA Coated tubes for blood collection |
| Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding | Bed-O-Cobs | BEDO1/4 | Novel bedding for novelty suppressed feeding |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5424 R | For centrifugation of blood. |
| Corticosterone ELISA Kit | Arbor Assays | K003-H1W | |
| Digital Camera | Panasonic | HC-V770 | Camera to record EPM/Experimenter interactions |
| Elevated Plus Maze | Home Made | n/a | Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor |
| Ethanol | Medstore House Brand | 39753-P016-EA95 | Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning |
| Ethovision XT 15 | Noldus | n/a | Automated animal tracking software |
| Laboratory Rodent Diet | LabDiet | Rodent Diet 5001 | Standard Rodent diet |
| Memory Card | Kingstone Technology | SDA3/64GB | For video recording and file transfer |
| Novelty Suppressed Feeding Chamber | Home Made | n/a | Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall . |
| Parlycarbonate tubes | Home Made | n/a | 13 cm in length and 5cm in diameter |
| Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding | Purina | n/a | Standard Bedding |
| Spectrophotometer | Biotek | Epoch Microplate Reader |
References
- Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936 (2006).
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Martic-Kehl, M., Ametamey, S., Alf, M., Schubiger, P., Honer, M. Impact of inherent variability and experimental parameters on the reliability of small animal PET data. EJNMMI Research. 2 (1), 26 (2012).
- Howard, B. R. Control of Variability. ILAR Journal. 43 (4), 194-201 (2002).
- Toth, L. A. The influence of the cage environment on rodent physiology and behavior: Implications for reproducibility of pre-clinical rodent research. Experimental Neurology. 270, 72-77 (2015).
- Golini, E., et al. A Non-invasive Digital Biomarker for the Detection of Rest Disturbances in the SOD1G93A Mouse Model of ALS. Frontiers in Neuroscience. 14 (896), (2020).
- Singh, S., Bermudez-Contreras, E., Nazari, M., Sutherland, R. J., Mohajerani, M. H. Low-cost solution for rodent home-cage behaviour monitoring. PLoS One. 14 (8), 0220751 (2019).
- Stewart, K., Schroeder, V. A. Rodent Handling and Restraint Techniques. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
- Gouveia, K., Hurst, J. L. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Scientific Reports. 9 (1), 20305 (2019).
- Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999 (2017).
- Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
- Wahlsten, D., et al. Different data from different labs: lessons from studies of gene-environment interaction. Journal of Neurobiology. 54 (1), 283-311 (2003).
- Nature Neuroscience. Troublesome variability in mouse studies. Nature Neuroscience. 12 (9), 1075 (2009).
- Sensini, F., et al. The impact of handling technique and handling frequency on laboratory mouse welfare is sex-specific. Scientific Reports. 10 (1), 17281 (2020).
- Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
- Novak, J., Bailoo, J. D., Melotti, L., Rommen, J., Würbel, H. An Exploration Based Cognitive Bias Test for Mice: Effects of Handling Method and Stereotypic Behaviour. PLoS One. 10 (7), 0130718 (2015).
- Gouveia, K., Waters, J., Hurst, J. L. Mouse Handling Tutorial. NC3Rs. , (2016).
- Gouveia, K., Hurst, J. L. Reducing Mouse Anxiety during Handling: Effect of Experience with Handling Tunnels. PLoS One. 8 (6), 66401 (2013).
- Henderson, L. J., Smulders, T. V., Roughan, J. V. Identifying obstacles preventing the uptake of tunnel handling methods for laboratory mice: An international thematic survey. PLoS One. 15 (4), 0231454 (2020).
- Percie Du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLOS Biology. 18 (7), 3000410 (2020).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
- Guilloux, J. P., Seney, M., Edgar, N., Sibille, E. Integrated behavioral z-scoring increases the sensitivity and reliability of behavioral phenotyping in mice: relevance to emotionality and sex. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 21-31 (2011).
- LaFollette, M. R., et al. Laboratory Animal Welfare Meets Human Welfare: A Cross-Sectional Study of Professional Quality of Life, Including Compassion Fatigue in Laboratory Animal Personnel. Frontiers in Veterinary Science. 7 (114), (2020).
- Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
- Bailoo, J. D., et al. Effects of Cage Enrichment on Behavior, Welfare and Outcome Variability in Female Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, (2018).
- Spangenberg, E. M., Keeling, L. J. Assessing the welfare of laboratory mice in their home environment using animal-based measures – a benchmarking tool. Laboratory Animals. 50 (1), 30-38 (2016).
- Theil, J. H., et al. The epidemiology of fighting in group-housed laboratory mice. Scientific Reports. 10 (1), 16649 (2020).
- Weber, E. M., Dallaire, J. A., Gaskill, B. N., Pritchett-Corning, K. R., Garner, J. P. Aggression in group-housed laboratory mice: why can’t we solve the problem. Lab Animal. 46 (4), 157-161 (2017).
- Cloutier, S., Baker, C., Wahl, K., Panksepp, J., Newberry, R. C. Playful handling as social enrichment for individually- and group-housed laboratory rats. Applied Animal Behaviour Science. 143 (2), 85-95 (2013).
- Panksepp, J., Burgdorf, J. 50-kHz chirping (laughter?) in response to conditioned and unconditioned tickle-induced reward in rats: effects of social housing and genetic variables. Behavioural Brain Research. 115 (1), 25-38 (2000).
