Summary

Técnicas de manejo para reducir el estrés en ratones

Published: September 25, 2021
doi:

Summary

Este artículo describe una técnica de manejo en ratones, la técnica de manejo 3D, que facilita el manejo de rutina al reducir los comportamientos similares a la ansiedad y presenta detalles sobre dos técnicas relacionadas existentes (manejo de túnel y cola).

Abstract

Los animales de laboratorio son sometidos a múltiples manipulaciones por parte de científicos o proveedores de cuidado de animales. El estrés que esto causa puede tener efectos profundos en el bienestar animal y también puede ser un factor de confusión para variables experimentales como las medidas de ansiedad. A lo largo de los años, se han desarrollado técnicas de manejo que minimizan el estrés relacionado con el manejo con un enfoque particular en las ratas y poca atención a los ratones. Sin embargo, se ha demostrado que los ratones pueden habituarse a manipulaciones utilizando técnicas de manipulación. Habituar a los ratones al manejo reduce el estrés, facilita el manejo de rutina, mejora el bienestar animal, disminuye la variabilidad de los datos y mejora la confiabilidad experimental. A pesar de los efectos beneficiosos del manejo, el enfoque de recogida de cola, que es particularmente estresante, todavía se usa ampliamente. Este documento proporciona una descripción detallada y una demostración de una técnica de manejo de ratones recientemente desarrollada destinada a minimizar el estrés experimentado por el animal durante la interacción humana. Esta técnica manual se realiza durante 3 días (técnica de manipulación 3D) y se centra en la capacidad del animal para habituar al experimentador. Este estudio también muestra el efecto de las técnicas de manipulación de túneles previamente establecidas (utilizando un túnel de policarbonato) y la técnica de recogida de cola. Específicamente se estudian sus efectos sobre comportamientos similares a la ansiedad, utilizando pruebas de comportamiento (Laberinto Elevado-Plus y Alimentación Suprimida por Novedad), interacción voluntaria con experimentadores y medición fisiológica (niveles de corticosterona). La técnica de manejo 3D y la técnica de manejo de túneles redujeron los fenotipos similares a la ansiedad. En el primer experimento, utilizando ratones machos de 6 meses de edad, la técnica de manejo 3D mejoró significativamente la interacción del experimentador. En el segundo experimento, utilizando una hembra de 2,5 meses de edad, redujo los niveles de corticosterona. Como tal, el manejo 3D es un enfoque útil en escenarios donde la interacción con el experimentador es requerida o preferida, o donde el manejo del túnel puede no ser posible durante el experimento.

Introduction

Los ratones y las ratas son activos esenciales para los estudios preclínicos1,2 para múltiples propósitos, incluidos los estudios endocrinos, fisiológicos, farmacológicos o conductuales2. A partir del creciente número de estudios con animales, surgió que las variables ambientales no controladas, incluida la interacción humana, influyen en diversos resultados en la investigación biomédica3,4,5. Esto es responsable de la variabilidad significativa observada en los experimentos y laboratorios de investigación4,5, lo que plantea una advertencia importante en la investigación con animales.

Se han implementado varios enfoques con el objetivo de limitar el impacto de los factores estresantes ambientales y reducir la reactividad a la interacción humana. Por ejemplo, para limitar el impacto de los factores estresantes ambientales, la estandarización de las condiciones de la vivienda y los sistemas de viviendaautomatizados 6,7 se han implementado en todos los laboratorios. Con respecto a la interacción con los seres humanos, los enfoques comúnmente utilizados para el manejo y transporte de animales tenían poca consideración por la incomodidad y el estrés de los animales. Por ejemplo, recoger animales por la cola o usar pórceps8 aumenta la ansiedad basal9,10,11,reduce la exploración9,12 y contribuye en gran medida a la variabilidad interindividual dentro y entre los estudios13,14. Como resultado, se desarrollaron otros enfoques, como la técnica de manejo de copas, que es aplicable a ratones y ratas. En este enfoque, los animales son “ahuecarados” fuera de su jaula, y sostenidos por los experimentadores con sus manos formando una taza9,10,11. Otra alternativa útil al manejo de la cola implica el uso de un túnel de policarbonato para transferir ratones9,10,15. Este enfoque elimina la interacción directa entre el ratón y el experimentador. Tanto los enfoques de copa como de túnel mostraron eficacia en la reducción de comportamientos similares a la ansiedad y el miedo al experimentador que pueden ser exagerados por técnicas de manejo aversivo, como el recogimiento de cola / manejo de cola9,10.

Por lo tanto, la creciente evidencia demuestra la utilidad del manejo adecuado del ratón para reducir la variabilidad entre individuos9,11y mejorar el bienestar animal10. Sin embargo, las técnicas mencionadas anteriormente todavía se enfrentan a limitaciones. La técnica de manejo de copas se ha implementado con horarios que van desde 10 días (10 sesiones durante 2 semanas16)hasta 15 semanas17,que es una cantidad considerable de tiempo para el personal de las instalaciones y los experimentadores. Además, la efectividad del manejo de la copa varía según la cepa9 y el manejo convencional de la copa en manos abiertas puede conducir a ratones ingenuos o cepas particularmente saltarines para saltar de la mano9,18. El manejo del túnel da como resultado resultados más consistentes y generalmente más rápidos en el gentling19. Los túneles también se utilizan como enriquecimiento de jaulas domésticas. Ayudan a los animales a habituar a la manipulación rápida y proporcionan los beneficios adicionales del enriquecimiento. El manejo de túneles, sin embargo, tiene limitaciones al transferir animales entre aparatos. Curiosamente, Hurst y West9,y Henderson et al.20 demostraron que el uso de un manejo manual suave y breve para transferir animales del túnel al aparato no afecta su fenotipo.

Para proporcionar una alternativa a los métodos existentes, con habituación alcanzable en un corto período de tiempo, este artículo describe una técnica novedosa que amplía la técnica de manipulación de la copa, por lo tanto, no requiere ningún equipo en particular. Este enfoque utiliza hitos para medir el nivel de comodidad que tienen los ratones con el proceso de manipulación. Muestra eficacia para disminuir la reactividad y el estrés del ratón (a nivel conductual y hormonal), facilita el manejo rutinario y contribuye a reducir la variabilidad entre animales. Los detalles de esta técnica se proporcionan aquí, y su eficacia para reducir los comportamientos similares a la ansiedad, mejorar la interacción con los experimentadores y limitar la liberación periférica de la hormona del estrés (corticosterona) se demuestra en dos estudios separados (ratones machos y hembras), en comparación con el manejo del túnel (control positivo) y las técnicas de manejo de la cola (control negativo).

Protocol

Los procedimientos que involucran sujetos animales fueron aprobados por el comité de cuidado de animales de CAMH y se llevaron a cabo de conformidad con las pautas del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. NOTA: El método de manipulación descrito en este documento se puede utilizar en varias cepas de ratón, incluidas las líneas no transgénicas (C57 / BL6, BalbC, CD1, SV129, etc.) y transgénicas. También se puede usar con ratones jóvenes o viejos, teniendo en cuenta que los ratone…

Representative Results

Se realizaron dos estudios separados con ratones C57BL/6. Los #1 del estudio incluyeron hombres de 6 meses de edad y #2 de estudio incluyeron mujeres de 2,5 meses de edad (N = 36 / estudio) de Jackson Laboratories (Cat #000664). Los ratones llegaron a las instalaciones a la edad de 2 meses. Mientras que las mujeres #2 del Estudio fueron manipuladas y evaluadas dos semanas después de su llegada, el Estudio #1 los hombres solo fueron manipulados y probados a la edad de 6 meses (retraso debido al cierre de la pandemia mund…

Discussion

Este estudio y desarrollo de métodos se basan en la observación de que las técnicas de manejo en ratones todavía son pasadas por alto por la comunidad científica, y que algunos laboratorios aún son reacios a implementar técnicas de habituación o manejo para reducir el estrés y la reactividad de sus animales antes de los experimentos. Si bien representa un compromiso de tiempo, el manejo de animales proporciona efectos beneficiosos para los animales que pueden contribuir al éxito de los experimentos a realizar y…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen al Comité de Cuidado Animal de CAMH por apoyar este trabajo, así como a los cuidadores de animales de CAMH que proporcionaron una amplia retroalimentación sobre la utilidad del procedimiento, motivando la ejecución de los experimentos descritos y la presentación del protocolo detallado para otros usuarios. Este trabajo fue financiado en parte por CAMH BreakThrough Challenge, otorgado a TP, y por fondos internos de CAMH.

Materials

23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel. BD 2546-CABD305145 Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk BD 367841 EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding Bed-O-Cobs BEDO1/4 Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5424 R For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit Arbor Assays K003-H1W
Digital Camera Panasonic HC-V770 Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze Home Made n/a Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol Medstore House Brand 39753-P016-EA95 Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15 Noldus n/a Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet LabDiet Rodent Diet 5001 Standard Rodent diet
Memory Card Kingstone Technology SDA3/64GB For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber Home Made n/a Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes Home Made n/a 13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding Purina n/a Standard Bedding
Spectrophotometer Biotek Epoch Microplate Reader

References

  1. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936 (2006).
  2. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  3. Martic-Kehl, M., Ametamey, S., Alf, M., Schubiger, P., Honer, M. Impact of inherent variability and experimental parameters on the reliability of small animal PET data. EJNMMI Research. 2 (1), 26 (2012).
  4. Howard, B. R. Control of Variability. ILAR Journal. 43 (4), 194-201 (2002).
  5. Toth, L. A. The influence of the cage environment on rodent physiology and behavior: Implications for reproducibility of pre-clinical rodent research. Experimental Neurology. 270, 72-77 (2015).
  6. Golini, E., et al. A Non-invasive Digital Biomarker for the Detection of Rest Disturbances in the SOD1G93A Mouse Model of ALS. Frontiers in Neuroscience. 14 (896), (2020).
  7. Singh, S., Bermudez-Contreras, E., Nazari, M., Sutherland, R. J., Mohajerani, M. H. Low-cost solution for rodent home-cage behaviour monitoring. PLoS One. 14 (8), 0220751 (2019).
  8. Stewart, K., Schroeder, V. A. Rodent Handling and Restraint Techniques. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
  9. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  10. Gouveia, K., Hurst, J. L. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Scientific Reports. 9 (1), 20305 (2019).
  11. Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999 (2017).
  12. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  13. Wahlsten, D., et al. Different data from different labs: lessons from studies of gene-environment interaction. Journal of Neurobiology. 54 (1), 283-311 (2003).
  14. Nature Neuroscience. Troublesome variability in mouse studies. Nature Neuroscience. 12 (9), 1075 (2009).
  15. Sensini, F., et al. The impact of handling technique and handling frequency on laboratory mouse welfare is sex-specific. Scientific Reports. 10 (1), 17281 (2020).
  16. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  17. Novak, J., Bailoo, J. D., Melotti, L., Rommen, J., Würbel, H. An Exploration Based Cognitive Bias Test for Mice: Effects of Handling Method and Stereotypic Behaviour. PLoS One. 10 (7), 0130718 (2015).
  18. Gouveia, K., Waters, J., Hurst, J. L. Mouse Handling Tutorial. NC3Rs. , (2016).
  19. Gouveia, K., Hurst, J. L. Reducing Mouse Anxiety during Handling: Effect of Experience with Handling Tunnels. PLoS One. 8 (6), 66401 (2013).
  20. Henderson, L. J., Smulders, T. V., Roughan, J. V. Identifying obstacles preventing the uptake of tunnel handling methods for laboratory mice: An international thematic survey. PLoS One. 15 (4), 0231454 (2020).
  21. Percie Du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLOS Biology. 18 (7), 3000410 (2020).
  22. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
  23. Guilloux, J. P., Seney, M., Edgar, N., Sibille, E. Integrated behavioral z-scoring increases the sensitivity and reliability of behavioral phenotyping in mice: relevance to emotionality and sex. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 21-31 (2011).
  24. LaFollette, M. R., et al. Laboratory Animal Welfare Meets Human Welfare: A Cross-Sectional Study of Professional Quality of Life, Including Compassion Fatigue in Laboratory Animal Personnel. Frontiers in Veterinary Science. 7 (114), (2020).
  25. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  26. Bailoo, J. D., et al. Effects of Cage Enrichment on Behavior, Welfare and Outcome Variability in Female Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, (2018).
  27. Spangenberg, E. M., Keeling, L. J. Assessing the welfare of laboratory mice in their home environment using animal-based measures – a benchmarking tool. Laboratory Animals. 50 (1), 30-38 (2016).
  28. Theil, J. H., et al. The epidemiology of fighting in group-housed laboratory mice. Scientific Reports. 10 (1), 16649 (2020).
  29. Weber, E. M., Dallaire, J. A., Gaskill, B. N., Pritchett-Corning, K. R., Garner, J. P. Aggression in group-housed laboratory mice: why can’t we solve the problem. Lab Animal. 46 (4), 157-161 (2017).
  30. Cloutier, S., Baker, C., Wahl, K., Panksepp, J., Newberry, R. C. Playful handling as social enrichment for individually- and group-housed laboratory rats. Applied Animal Behaviour Science. 143 (2), 85-95 (2013).
  31. Panksepp, J., Burgdorf, J. 50-kHz chirping (laughter?) in response to conditioned and unconditioned tickle-induced reward in rats: effects of social housing and genetic variables. Behavioural Brain Research. 115 (1), 25-38 (2000).

Play Video

Cite This Article
Marcotte, M., Bernardo, A., Linga, N., Pérez-Romero, C. A., Guillou, J., Sibille, E., Prevot, T. D. Handling Techniques to Reduce Stress in Mice. J. Vis. Exp. (175), e62593, doi:10.3791/62593 (2021).

View Video