Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

طريقة تسجيل مجهرية آلية لإجراء فحص foci γ-H2AX في الخلايا الليمفاوية الطرفية للدم البشري

Published: December 25, 2021 doi: 10.3791/62623
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1, 1, 1, 1, 4, 5, 6, 1
1Radiation Biophysics Division, Nuclear Medicine Department, iThemba LABS, 2Department of Biotechnology, University of the Western Cape, 3Department of Medical Biosciences, University of the Western Cape, 4Division of Medical Physiology, Department of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, 5Biodosimetry Service, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable and Academic Unit on Radiation Protection, Faculty of Medicine, University of the Republic, 6MetaSystems Hard & Software GmbH

Summary

يقدم هذا البروتوكول إعداد الشريحة والتهديف الآلي للاختبارات البؤرية γ-H2AX على الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي. لتوضيح طريقة وحساسية المقايسة ، تم تشعيع الخلايا اللمفاوية المعزولة في المختبر. هذه الطريقة الآلية للكشف عن الحمض النووي DSB مفيدة لتطبيقات قياس الجرعات البيولوجية سريعة وعالية الإنتاجية.

Abstract

الإشعاع المؤين هو محفز قوي لتلف الحمض النووي ومسرطن موثق جيدا. ويشمل قياس الجرعات البيولوجية الكشف عن الآثار البيولوجية الناجمة عن التعرض للإشعاع المؤين لإجراء تقييم الجرعة الفردية. وهذا أمر وثيق الصلة بالموضوع في إطار حالات الطوارئ الإشعاعية، حيث تكون التقييمات الصحية والتخطيط للعلاج السريري للضحايا المعرضين للخطر حاسمة. وبما أن فواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي (DSB) تعتبر الشكل الأكثر فتكا من تلف الحمض النووي الناجم عن الإشعاع، يقدم هذا البروتوكول طريقة للكشف عن الحمض النووي DSB في عينات الدم. وتستند المنهجية إلى الكشف عن بروتين إصلاح الحمض النووي المسمى الفوسفوري الفلوري، أي γ-H2AX. استخدام منصة المجهر الآلي لتسجيل عدد من بؤر γ-H2AX لكل خلية يسمح بتحليل موحد مع انخفاض كبير في الوقت بدوره حولها. ولذلك، فإن γ-H2AX يمكن أن يكون واحدا من أسرع القياسات وأكثرها حساسية لقياس الجرعات البيولوجية. في هذا البروتوكول، سيتم معالجة عينات الدم الكامل من المتطوعين البالغين الأصحاء وإشعاعها في المختبر من أجل توضيح استخدام الفحص الآلي والحساس γ-H2AX لتطبيقات قياس الجرعات الحيوية. يتم استخدام نظام مسح الشرائح الآلي ومنصة التحليل مع المجهر الفلوري المتكامل ، والذي يسمح بتسجيل سريع وتلقائي ل DSB الحمض النووي بدرجة منخفضة من التحيز.

Introduction

وقد أصبح الإشعاع المؤين منذ اكتشافه أداة لا غنى عنها في الممارسات الطبية والصناعية الحالية، وكذلك في التطبيقات الزراعية والعسكرية. ومع ذلك، فإن الاستخدام الواسع النطاق للأشعة تحت الحمراء يزيد أيضا من خطر التعرض المفرط للإشعاع لكل من العاملين المهنيين في مجال الإشعاع وكذلك لأفراد الجمهور. الأشعة تحت الحمراء هي مادة مسرطنة مادية معروفة يمكن أن تسبب تلف الحمض النووي بطريقة مباشرة أو غير مباشرة ، مما يؤدي إلى مخاطر صحية كبيرة 1،2. لذلك ، من المهم إجراء تقييم الجرعة ، لأن درجة التعرض تشكل خطوة أولية مهمة في إدارة حادث الإشعاع 1.

في حالة حدوث حالات طوارئ نووية أو إشعاعية واسعة النطاق ، يمكن أن يتراوح عدد تقييمات الجرعة التي تحتاج إلى إجراء من بضعة إلى آلاف الأشخاص اعتمادا على حجم الحادث3. في هذه السيناريوهات، قد يكون قياس الجرعات المادية غامضا أيضا (على سبيل المثال، إذا لم يتم ارتداء مقياس الجرعات بشكل صحيح) أو غير متوفر، عندما يشارك أفراد الجمهور. في حين يمكن استخدام الأعراض السريرية للفرز ، إلا أنها ليست بالضرورة محددة للإشعاع ويمكن أن تؤدي إلى تشخيص خاطئ. لذلك ، من المستحسن استخدام قياس الجرعات البيولوجية جنبا إلى جنب مع قياس الجرعات الفيزيائية والتقييمات السريرية. تسمح هذه الطريقة بتحليل التغيرات الناجمة عن الإشعاع على المستوى الخلوي وتمكن من تحديد الأفراد المعرضين بشكل لا لبس فيه الذين يحتاجون إلى علاج طبي4. يمكن للطبيب بعد ذلك استخدام هذا التقييم الجرعة البيولوجية لاستكمال إعادة بناء الجرعة المادية والتشخيصات السريرية الأخرى, من أجل وصف الرعاية الطبية المناسبة5. وستكون الحاجة إلى قياس الجرعات البيولوجية عالية بشكل خاص بالنسبة لفرز الإصابات وإدارتها طبيا عندما لا يكون سيناريو التعرض معروفا جيدا وعندما يكون الضحايا من أفراد الجمهور. والغرض الرئيسي من الفرز هو التمييز الفعال بين الأشخاص "القلقين بشكل جيد"، الذين يمكن أن تكون لديهم أعراض برودرومال ولكنهم لم يتلقوا جرعة عالية، وبين الأشخاص المعرضين الذين يحتاجون إلى مساعدة طبية فورية ورعاية متخصصة. مستوى عتبة الجرعة الإشعاعية التي يمكن أن تسبب مرض الإشعاع هو حوالي 0.75 - 1.00 Gy. ثم, هؤلاء الأفراد الذين يتلقون > 2 Gy التعرض هم أكثر عرضة للإصابة بمتلازمة الإشعاع الحاد وينبغي أن تتلقى العلاج الطبي الفوري6,7. وتكون تقديرات الجرعة البيولوجية الدقيقة في الوقت المناسب للضحايا الذين وقعوا في مرمى نيران هذه الكوارث حاسمة. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يمكن أيضا الراحة وطمأنة الضحايا المعرضين الحد الأدنى8.

تستخدم سلطات الحماية من الإشعاع علامات قياس الجرعات الحيوية المختلفة ، والتي تستند بشكل رئيسي إلى اكتشاف الضرر الوراثي الخلوي ، مثل الكروموسومات ثنائية المركز أو النوى الدقيقة ، في الخلايا الليمفاوية البشرية المستزرعة9. الكشف عن الضرر الوراثي الخلوي يمكن أيضا أن يتم عن طريق الفلورسنت في الموقع التهجين (FISH) نقل المقايسة10. ومع ذلك ، فإن العيب الرئيسي للطرق الوراثية الخلوية التقليدية هو وقت التحول الطويل للحصول على النتائج في حالة الطوارئ8.

واحدة من أقدم الخطوات في عملية التعرف على الحمض النووي DSB هو الفوسفور من البديل الهستون H2AX، مما يؤدي إلى تشكيل γ-H2AX، والتوظيف اللاحقة لعوامل الإصلاح. على مدى العقد الماضي، تلقى الكشف عن بؤر γ-H2AX الناجمة عن الإشعاع في الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي باستخدام المجهر المناعي اهتماما متزايدا كأداة قياس الجرعات البيولوجية الموثوقة11،12،13،14،15. اعتمادا على جودة الإشعاع ونوع الخلية، يتم الكشف عن العائد الأقصى من بؤر γ-H2AX في غضون 0.5 - 1 ساعة بعد التشعيع16،17. ومن المتوقع أن يكون هناك ارتباط وثيق بين عدد الحمض النووي DSB و بؤر γ-H2AX، وكذلك بين اختفاء البؤر وإصلاح DSB. وقد أظهرت تجارب مقص الليزر مع ميكروب ليزر نبضي أن γ-H2AX بؤر توطين لمواقع الحمض النووي DSB18. في حين أنه لا يزال موضوعا للنقاش النشط، واحدة من الدراسات الأولى مع 125اقترحت علاقة واحدة إلى واحد بين العدد المحسوب من التفكك لكل خلية (قابلة لتمثيل لعدد من الحمض النووي الناجم عن الإشعاع DSB) وعدد بؤر γ-H2AX التي تم تسجيلها19،20.

على مدى العقد الماضي، مول الاتحاد الأوروبي مشروعي MULTIBIODOSE (أدوات قياس الأعماق الحيوية متعددة التخصصات لإدارة الإصابات الإشعاعية على نطاق واسع) ومشروع RENEB (تحقيق الشبكة الأوروبية لقياس الجرعات الحيوية) لإنشاء شبكة مستدامة في مجال قياس الجرعات البيولوجية وال بأثر رجعي21,22. وشمل هذا المشروع مختبرات مختلفة في جميع أنحاء أوروبا لتقييم قدرات الاستجابة لحالات الطوارئ في حالة الطوارئ الإشعاعية14,21,22. و γ-H2AX foci المقايسة لديها عدد من المزايا الكبيرة، مثل وقت المعالجة السريعة، وإمكانية معالجة دفعة السماح لسرعة الإنتاجية العالية، فضلا عن حساسيتها العالية إذا استخدمت في غضون ساعات قليلة بعد التعرض13,23,24. أدت الحساسية العالية للمقايسة في نطاق الجرعة المنخفضة إلى عدد من الدراسات التي استخدم فيها اختبار بؤر γ-H2AX كمؤشر على تأثير التعرض للإشعاع الطبي ، سواء في العلاج الإشعاعي أو في تطبيقات التصوير التشخيصي25,26,27,28,29,30. وهذه الخصائص تجعل من γ-H2AX foci asay بديلا تنافسيا للغاية للأساليب الأخرى للفرز المبكر في الحوادث النووية الكبيرة لفصل الأشخاص المعرضين بشدة عن الأفراد ذوي المخاطر المنخفضة. وقد أوضحت العديد من التجارب التحسين أنه من الممكن إجراء γ-H2AX foci المقايسة مع كميات صغيرة من الدم، مثل دراسة موكيه وآخرون الذين أفادوا أنه من الممكن إجراء γ-H2AX foci المقايسة مع قطرة دم فقط (وخز الإصبع)31. وقد استخدم نهج مماثل في تطوير نظام RABIT (أداة القياس البيولوجي الآلي السريع) المؤتمت بالكامل والذي تم تحسينه لقياس غلة γ-H2AX من عينات الدم المشتقة من عصا الإصبع32,33. وبشكل عام، تشير نتائج الدراسات المقارنة بين MULTIBIODOSE وRENEB إلى أن اختبار بؤر γ-H2AX يمكن أن يكون أداة فرز مفيدة للغاية بعد التعرض للإشعاع الحاد مؤخرا (حتى 24 ساعة)12,13,14. في دراسة مقارنة بين نطاق الجرعة المنخفضة ، يمكن تمييز جرعة منخفضة يصل إلى 10 mGy عن عينات التحكم المشععة ، مما يسلط الضوء على حساسية المقايسة في نطاق الجرعة المنخفضة34. من المهم ملاحظة أن الحساسية العالية للمقايسة صحيحة بشكل خاص للخلايا الليمفاوية ، مما يجعلها واحدة من أنسب أنواع الخلايا لتقييم التعرض للجرعات المنخفضة. الخلايا الليمفاوية هي أساسا خلايا غير ركوب الدراجات وتمثل السكان متزامن. هذا الأخير يتجنب التعبير عن γ-H2AX يرتبط مع تكرار الحمض النووي، مما يقلل بشكل كبير من حساسية المقايسة للكشف عن DSB الناجم عن الإشعاع خلال G2 و S-المرحلة من دورة الخلية35. بالإضافة إلى حساسيته للجرعات المنخفضة للخلايا الليمفاوية ، فإن وقت التحول في فحص بؤر γ-H2AX أسرع بكثير من التقنيات الجينية الخلوية مثل المقايسة ثنائية المركز والنووية الدقيقة ، لأنها لا تتطلب تحفيز الخلايا الليمفاوية. لذلك، يمكن الحصول على النتائج في غضون ساعات قليلة مقارنة مع بضعة أيام للتقنيات الوراثية الخلوية. ومن العيوب الرئيسية للمقايسة الاختفاء السريع لإشارة بؤر γ-H2AX، التي عادة ما تنخفض إلى مستويات خط الأساس في غضون أيام بعد التعرض للإشعاع اعتمادا على الحركية إصلاح الحمض النووي36. ولذلك، فإن أنسب تطبيق للمقايسة في سياق قياس الجرعات الحيوية هو لأغراض الفرز الأولية وإعطاء الأولوية لمتابعة قياس الجرعات البيولوجية الجينية الخلوية الأكثر استهلاكا للوقت بالنسبة لبعض الضحايا. ومع ذلك ، لقياس الجرعات الحيوية بأثر رجعي دقيق والآثار على المدى الطويل ، يجب على المرء الاعتماد على التقنيات الجينية الخلوية مثل تحليلات FISH ثلاثية الألوان للكشف عن الانحرافات الكروموسومية المستقرة في حالة حدوث التعرض قبل عدة سنوات10.

وكجزء من عدة مبادرات لقياس الجرعات الحيوية، تم تقييم العديد من المقاييس لأغراض الفرز بجانب المقايسة البؤرية γ-H2AX لفرز الأشخاص في حالات الطوارئ الإشعاعية الواسعة النطاق؛ مثل المقايسة ثنائية المركز، و المقايسة الميكرونوكليوس كتلة السيتوكينيز، الرنين المغناطيسي الإلكترون (EPR)، فحص بروتين المصل (SPA)، فحص بقع الجلد (SSA)، التلألؤ المحفز بصريا (OSL)، فضلا عن تحليل التعبير الجيني 37،38. يمكن استخدام γ-H2AX foci المقايسة كميا لتقييم تشكيل الحمض النووي DSB وإصلاح39. ومع ذلك ، فإن المقايسة تعتمد على الوقت حيث يختلف مستوى بؤر γ-H2AX مع مرور الوقت بعد التشعيع بسبب الحركية إصلاح الحمض النووي DSB40. وأوضحت دراسة مقارنة أن التهديف المجهري مع قدرة z-المرحلة يقدم النتائج الأكثر دقة بعد 1 غي من الإشعاع، في حين أن قياس التدفق الخلوي يعطي فقط نتائج موثوقة بجرعات أعلى من الأشعة تحت الحمراء41. هناك العديد من التقارير عن تطوير حلول تحليل الصور لاستخدامها في تسجيل الآلي42،43،44،45،46. في هذا البروتوكول، يتم استخدام منصة المجهر الفلوري الآلي عالية الإنتاجية لتحليل بؤر γ-H2AX في الخلايا الليمفاوية الطرفية في الدم. استخدام نظام التهديف التلقائي يتجنب التحيز التهديف بين المختبر وبين المراقبين، في حين أنه لا يزال يسمح حساسية كافية للكشف عن جرعات أقل من 1 غي47. الميزة الأساسية لهذا النظام مقارنة مع البرمجيات الحرة مفتوحة المصدر لتسجيل بؤر هو حقيقة أن العملية الكاملة من مسح الشرائح لالتقاط وتسجيل الآلي. مفهوم المصنفات القابلة للتعريف والمستور يضمن القابلية لإعادة الإنتاج مما يضيف درجة غير متحيزة من الجودة إلى النتائج. ولذلك، يوضح هذا العمل كيف يمكن الحصول على نتائج بؤر γ-H2AX باستخدام طريقة المسح المجهري الآلي والتهديف التي يمكن استخدامها عندما يتم تلقي عينات الدم من الأفراد الذين يحتمل أن يكونوا أكثر تعرضا من قبل مختبرات البيولوجيا الإشعاعية لأغراض قياس الجرعات البيولوجية.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات البحوث الطبية الحيوية التابعة للجنة أخلاقيات جامعة ويسترن كيب - Code BM18/6/12.

1. إعداد حلول48

  1. حل تثبيت الخلية (3٪ PFA في PBS)
    1. ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) والعمل في غطاء الدخان، إضافة 20 غرام من paraformaldehyde إلى 200 مل من المقطر H2O. تسخين الخليط إلى 60 درجة مئوية للمساعدة في حل.
    2. بمجرد حل PFA، أضف 40 قطرة من 5 N NaOH بعناية على مدى 30 دقيقة وتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. ضبط إلى درجة الحموضة 7 باستخدام 1 M HCl وجعل ما يصل إلى حجم النهائي من 250 مل مع المقطر H2O (يمكن تخزين aliquots في -20 درجة مئوية لمدة 1 سنة). أضف 25 مل من هذا الحل إلى 41.7 مل من برنامج تلفزيوني لتوفير حل PFA بنسبة 3٪.
  2. 1٪ مصل البقر الألبومين (BSA) الحل: إضافة 10 غرام من جيش بي إس أي إلى 1000 مل من برنامج تلفزيوني ومزيج حتى يذوب. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام (72 ساعة كحد أقصى).
  3. Triton-X الحل بتركيز 1:500: إضافة 1 ميكرولتر من تريتون-X إلى 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني, تخزين في 4 °C حتى استخدام (الحد الأقصى 24 ساعات).
  4. حلول الأجسام المضادة
    1. الأجسام المضادة الأولية - مضادة γ-H2AX بتركيز 1:500: إضافة 1 ميكرولتر من مضاد γ-H2AX إلى 500 ميكرولتر من محلول BSA بنسبة 1٪، وتخزينها عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام (الحد الأقصى 24 ساعة).
    2. الأجسام المضادة الثانوية - DAM-TRITC بتركيز 1:1000: أضف 1 ميكرولتر من DAM-TRITC إلى 1000 ميكرولتر من محلول BSA بنسبة 1٪، وتخزينها عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام (الحد الأقصى 24 ساعة).
  5. استكمال روزويل بارك معهد النصب التذكاري (cRPMI) وسائل الإعلام
    1. إضافة مصل البقر الجنيني المصفاة (FBS) وبينسلين-ستريبتومايسين إلى وسائل الإعلام RPMI 1640 في زجاجة معقمة لإعطاء تركيز نهائي من 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-ستريبتومايسين.

2. إعداد العينات

ملاحظة: لهذا البروتوكول، يتم جمع عينات الدم الكامل المحيطية عن طريق venipuncture في أنابيب جمع الليثيوم الهيبارين من المتطوعين البالغين الأصحاء (بموافقة مستنيرة - BM18/6/12 لجنة أخلاقيات البحوث الطبية الحيوية التابعة للجنة أخلاقيات جامعة كيب الغربية). قبل البدء، تأكد من أن الدم ومتوسط الكثافة 1.077 غرام/مل متأقلمان مع درجة حرارة الغرفة.

  1. في خزانة السلامة البيولوجية المعدة، تمييع الدم كله المحيطي في حجم 1:1 مع برنامج تلفزيوني وطبقة بلطف الدم المخفف على حجم متساو لحجمين من المتوسطة مع كثافة 1.077 غرام / مل. من المهم أن طبقة تدريجيا الدم على متوسط الكثافة عن طريق عقد أنبوب مائلة في 45°, ضمان أن الدم وكثافة المتوسطة لا تختلط.
  2. نقل التعليق بعناية إلى جهاز طرد مركزي وتدور في 900 × ز لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، ماصة طبقة "غائم" فقط إلى أنبوب مخروطي عقيم جديد وملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني والطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 1000 × ز. بعد ذلك ، يستنشق supernatant مع ماصة ، ويجري الحذر لعدم تعكير صفو بيليه ، resuspend بيليه PBMC بعناية في 1 مل برنامج تلفزيوني وملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني.
  3. كرر خطوة الغسيل أعلاه مرتين إضافيتين للوصول إلى ما مجموعه ثلاثة يغسل.
  4. عد عدد PBMCs باستخدام مقياس الدم، على علم بأن كل مل من الدم المحيطي من متبرع بالغ سيؤدي إلى متوسط تقريبي من 1-1.5 × 106 PBMCs49. بعد العد، تمييع بيليه PBMC إلى تركيز 8 × 105 الخلايا الليمفاوية في 1 مل من cRPMI. ثم أضف ما يقرب من 2 × 106 PBMCs أو 2.5 مل من محلول PBMC المعزول إلى أنبوب معقم ومخروطي للتشعيعات.

3. عينة من الإشعاعات

تنبيه: تعامل مع وحدة الإشعاع وفقا لإرشادات الحماية من الإشعاع وارتد مقياس الجرعات البدني في جميع الأوقات. تأكد من معايرة نظام التشعيع المستخدم وإعداده بحيث يتم تحقيق الجرعات المتوقعة الصحيحة.

  1. تشعيع PBMCs في درجة حرارة الغرفة باستخدام مصدر 60شركة. معايرة (TRS-398 بروتوكول) مع غرفة مزارع 117 التي عامل معايرة غرفة التي تم الحصول عليها من المعهد الوطني للمقاييس في جنوب أفريقيا (NMISA)50.
    1. لهذا المقايسة، ضع الأنابيب المخروطية بين ورقة أكريليك 5 مم (تستخدم لتراكم دخول الحزمة) و50 مم مادة ركاز الظهر مع معدل الجرعة المصدر الحالي 60Co من 0.57 Gy/min ل300 مم × حجم حقل متجانس 300 مم في مصدر 750 مم إلى مسافة السطح.
  2. تشعيع PBMCs مع جرعات متدرج من 0.125، 0.500، 1.000، 1.500 و 2.000 Gy، والحفاظ على عينات التحكم صورية المشععة، في غرفة التحكم، وتلقي التعرض للإشعاع المحيط فقط.
  3. احتضان العينات المشععة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5٪ الرطبة من أجل الوصول إلى الحد الأقصى لعدد بؤر γ-H2AX.
    ملاحظة: يمكن تعديل وقت الحضانة وفقا للتصميم التجريبي.

4. إعداد الشرائح

ملاحظة: راجع الشكل 1 لإعداد الشريحة.

  1. إعداد 3 شرائح (تكرارات تقنية) باستخدام شرائح مغلفة بسطح مشحون إيجابيا لتحسين التصاق لكل حالة تشعيع (أو لكل أنبوب مخروطي). ضع الشريحة في حامل القصاصة، وأضف بطاقة التصفية فوقها، وأخيرا القمع. تأمين مقاطع الشرائح ومكان في جهاز الطرد الخلوي.
  2. أضف 250 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى القمع (200,000 خلية/شريحة) وتدور لمدة 30 × غرام لمدة 5 دقائق باستخدام جهاز طرد خلوي.
  3. بعد الطرد الخلوي، قم بإزالة الشريحة من حامل القصاصة واستخدام قلم كاره للماء، وارسم دائرة حول البقعة مع الخلايا من أجل الاحتفاظ بالبقعة المناعية على الخلايا المقيدة أثناء عملية التلطيخ.

5. التثبيت والمناعة γ-H2AX تلطيخ

ملاحظة: يتم إضافة كافة الحلول بعناية مباشرة إلى منطقة الخلية التي تتميز بدائرة مسعورة. يتم الاستغناء عن حلول تلطيخ قليلا فوق الشريحة دون السماح لطرف ماصة لتعطيل الخلايا. لا تتم إضافة حلول إلى الشريحة بأكملها.

  1. إصلاح الشرائح في 3٪ PFA أعدت حديثا لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في PBS التي تحتوي على 0.5٪ PFA عند 4 درجة مئوية لمدة أقصاها يومين قبل إجراء التثقيف المناعي. بعد ذلك، غسل الشرائح في جرة كوبلين مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثم تغطية الخلايا مع 100 ميكرولتر من محلول تريتون X الباردة لمدة 10 دقائق للسماح permeabilization.
  2. قم بقلب محلول Triton-X على ورق الأنسجة واغسل الشرائح ثلاث مرات في محلول BSA بنسبة 1٪ لمدة 10 دقائق. ويتم ذلك لمنع الخلفية غير المرغوب فيها عن طريق منع ربط الأجسام المضادة غير المحددة.
  3. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة مع 100 ميكرولتر من 1:500 المخفف الأولية المضادة γ-H2AX الأجسام المضادة لمدة 1 ساعة في غرفة الترطيب، وإنجازها بسهولة عن طريق إضافة ورق الأنسجة الرطبة في قاعدة مربع تخزين الشرائح مستطيلة.
    1. قم بقلب محلول الأجسام المضادة على ورق الأنسجة وأجر ثلاثة يغسل بمحلول BSA بنسبة 1٪ لمدة 10 دقائق في جرة كوبلين لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المنضمة ومنع الربط غير المحدد للأجسام المضادة الثانوية.
  4. احتضان الشرائح مع 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة DAM-TRITC الثانوي المخفف 1:1000 لمدة ساعة واحدة في غرفة الترطيب. قم بقلب محلول الأجسام المضادة على ورق الأنسجة واغسل الشرائح في PBS لمدة 10 دقائق ثلاث مرات.
  5. وأخيرا تجفيف الشرائح خارج دائرة الكاره للماء مع لينة، ورقة الأنسجة الخالية من الغبار وإضافة 1-2 قطرات من DAPI حلها في وسط تصاعد مائي وتغطية بلطف الشريحة مع زلة غطاء 24 × 50 ملم، وضمان عدم وجود فقاعات الهواء المحاصرين ومكان في الثلاجة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. يمكن تخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين كحد أقصى قبل المسح الضوئي.

6. المسح الآلي وتسجيل الشرائح

ملاحظة: يحتاج نظام المسح الضوئي إلى مجهر فلوري، وكاميرا CCD عالية الدقة (جهاز مشحون مقرون) متصلة بملتقط إطارات لرقمنة صور الفيديو في الوقت الفعلي، ومرحلة مسح ضوئي، وكرة تتبع للحركات اليدوية، وماوس ثلاثي الأبعاد، وجهاز كمبيوتر سريع وجهاز عرض، وقرص صلب للأرشفة(الشكل 2).

  1. إعداد المصنف
    ملاحظة: المصنف هو مجموعة من المعلمات تعريف كيفية النظام بالكشف عن الخلايا. وهي تنتج عن التدريب على أساس حقول الصور السرية مسبقا. المصنف خاص بتكبير المجهر ونوع الخلية والمختبر. لذلك قد تتطلب المصنفات تعديلات في المعلمات التالية لتكييفها مع الظروف الحالية. من المستحسن اختبار الإعدادات باستخدام شريحة مرجعية قبل التقييم.
    1. الحصول على الصورة: استخدم هدفا جافا 40x للتصوير. لتحقيق جودة صورة قابلة للمقارنة في جميع الخلايا، قم بتعيين وقت تكامل الكاميرا إلى الوضع التلقائي. تعيين الحد الأقصى لوقت التكامل إلى ثانية واحدة على الأقل لكلا القناتين الملونتين (كسب الكاميرا 4.0). يتم الحصول على قناة الإشارة مع 10 طائرات التركيز و 14/40 ميكرومتر بين الطائرات.
    2. اختيار الخلية: يتم الكشف عن مركبات PBMCs ضمن نطاق 20.00 ميكرومتر2 و 76.00 ميكرومتر2. تعيين عمق التقعر الأقصى إلى 0.05 ونسبة العرض إلى الارتفاع الأقصى إلى 1.4. تعيين عتبة مستوى الرمادي النسبي إلى 20٪.
    3. معالجة الخلايا: معالجة قناة عدادات DAPI مع خوارزمية الحد الأقصى المدرج التكراري لتقليل الخلفية. تتم معالجة قناة الإشارة باستخدام فلتر TopHat (القوة 7، عامل التجانس 0) لتقليل الخلفية وتعزيز الإشارات.
    4. عد الإشارات: عدد البؤر باستخدام ميزة عدد الكائنات للجهاز. لتجنب التقييم الإيجابي الزائف لإشارات الخلفية المتبقية، يتم احتساب الإشارات التي تظهر 30٪ على الأقل من الكثافة بالمقارنة مع ألمع كائن في الخلية.
  2. إدراج / وضع الشرائح على منصة المسح الآلي أو مرحلة الشريحة، بعد تنظيفها بلطف مع الإيثانول 70٪، لإزالة أي غبار.
  3. إعداد الشرائح - فتح قائمة حوار إعداد الشرائح (الشكل 3)
    1. حدد مسار البياناتالصحيح ، وهذا يحدد مكان تخزين ملفات الشرائح الناتجة عن البحث.
    2. إعطاء الشريحة اسما، يجب إعطاء كل شريحة اسما فريدا. إذا تم إدخال سلسلة من الشرائح في شكل قائمة تعداد، يمكن استخدام '?' كحرف بدل لرقم الشريحة.
    3. حدد المصنف المناسب، كما هو موضح في القسم 1.1 - 1.4(الشكل 4).
    4. حدد نافذة البحث وحدد معرفا مسبقا إذا كان تعريف إطار البحث مطابقا لدائرة خلايا الطرد الخلوي موجودا، أو حدد التعريف المعني في عمود الحجم، أو حدد يدوي إذا لم يكن هناك تعريف محدد مسبقا لنافذة البحث. في هذه الحالة، لا يلزم تعيين العمود Size.
    5. حدد الحد الأقصى لعدد الخلايا وأضف الحد الأقصى لعدد الخلايا المطلوب فحصها. يتم إنهاء البحث حتى إذا لم يتم مسح إطار البحث المحدد بالكامل بعد بمجرد الوصول إلى الحد الأقصى لعدد الخلايا. بالنسبة لتطبيقات قياس الجرعات الحيوية، فإن التسجيل الآلي ل 1000 خلية لكل شريحة يكفي، بالنظر إلى أنه يتم إعداد 3 شرائح لكل عينة دم. انقر فوق موافق لتأكيد الإعدادات.
  4. إعداد مسح الشرائح
    1. انقر فوق الزر بحث على الشريط الجانبي. إذا تم تحديد الإعداد "إطار البحث اليدوي" في إعداد الشريحة، سيتم فتح حوار يسمح بتحديد منطقة المسح الضوئي(الشكل 5). باستخدام الهدف 10x حدد منطقة البحث مستطيلة على الشريحة بشكل تفاعلي عن طريق تحديد ركنين من حقل البحث بواسطة النقر الأيسر من الماوس. يمكن تأكيد ذلك باستخدام الزر موافق. إذا كان إطار البحث يشير إلى إطار بحث معرفة مسبقا، سيتم حذف هذه الخطوة.
    2. تتم مطالبة المستخدم بضبط موضع بدء التركيز. ثم سيتم تحديد كائن مرجعي تلقائيا، وسوف يطالب البرنامج المستخدم للتركيز ومركز نواة مرجعية (باستخدام الهدف 40x) لكل شريحة وتأكيد الإعدادات مع موافق. سينتقل النظام تلقائيا إلى كافة الشرائح بشكل تسلسلي. إذا لزم الأمر، ضبط إعداد صورة لايف - التكامل الوقت لهذه الخطوة ( الشكل5).
    3. تحقق من جميع إعدادات المجهر وتأكد من مطالبة النظام مع موافق. وسيبدأ النظام إجراء التركيز والمسح الآلي. بمجرد الانتهاء من المسح الضوئي يتم حفظ البيانات إلى الكمبيوتر للتحليل. يتم إيقاف تشغيل نظام المسح تلقائيا بعد اكتمال الفحص.
      ملاحظة: تأكد من أن ذراع أنبوب المجهر في وضع يحول كل الضوء إلى الكاميرا.
    4. نهاية البحث، يتم إنهاء البحث إذا تم مسح البحث بأكمله، أو إذا تم الوصول إلى الحد الأقصى لعدد الخلايا أو إذا تم إلغاء البحث.
  5. تحليل الشرائح
    ملاحظة: يتم تمثيل المسح المكتمل في الشكل 6.
    1. عند اكتمال الفحص، انقر فوق الزر معرض على الشريط الجانبي. مراجعة المعرض، الذي يتكون من صور صغيرة للخلايا المكتشفة. في هذه النافذة (الشكل 7)، حدد ما إذا كانت الخلايا المخزنة في المعرض حسب معيار يتم اختياره من القائمة المنسدلة. يتم عرض الخلايا بشكل عام بالترتيب الذي تم الكشف عنها به.
    2. انقر على الرسم البياني الجودة / ميزة الرسم البياني قيمة ( الشكل8) لإعطاء توزيع قياس الجودة للخلايا المكتشفة، فضلا عن وسائل، والانحراف المعياري لل البؤر سجل.

Representative Results

لهذا البروتوكول، تم عزل خلايا الدم المحيطي البشري أحادية النووية (PMBCs) من الدم الكامل لأربعة متطوعين بالغين أصحاء وتعرضت لجرعات إشعاعية من 0.125 و0.250 و0.500 و1.000 و2.000 Gy. وبعد ذلك، تم احتضان العينات لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطوبة 2 CO 5٪. بعد التثبيت وتلطيخ immunofluorescence ، يتم مسح الشرائح تلقائيا وسجلها. الأرقام 6و 7 و 8 تعطي تمثيلا لما مخرجات البرنامج للمستخدم. تظهر نافذة تحليل بمجرد اكتمال الفحص، مما يعطي لمحة عامة عن البؤرة المسجلة. المعرض يعطي جميع بؤر سجل مع القائمة التفاعلية التي يمكن حذف القيم المتطرفة وأخيرا يتم إعطاء مخطط بياني مع ملخص البيانات التفصيلية.

يتم عرض γ-H2AX بؤر العائد بعد التعرض للأشعة γ في الشكل 9. وكانت هناك زيادة تدريجية في عدد بؤر γ-H2AX بجرعة متزايدة. لا يوضح هذا الرسم البياني اعتماد الجرعة وحساسية المقايسة فحسب ، بل يمكن أيضا استخدام الملاءمة لإجراء تقدير الجرعة عند تلقي عينة من فرد تعرض لجرعة غير معروفة. من المهم أن نلاحظ أن المرء لن يكون لها السيطرة صورية الإشعاع أو مستويات بؤر الخلفية لهذا الفرد. ولذلك، يشمل الشكل 9 القيمة 0 Gy لعينات التحكم المشععة، التي كانت 0.57 ± 0.23 Gy للمتبرعين البالغين الأربعة في هذه الدراسة.

Figure 1
الشكل 1: إعداد الشرائح للطردالمركزيالخلوي. ضع الشريحة في حامل القصاصة، وأضف بطاقة التصفية فوقها، وأخيرا القمع. تأمين مقاطع الشرائح ومكان في جهاز الطرد الخلوي. بعد الطرد الخلوي، قم بإزالة الشريحة من حامل القصاصة وارسم دائرة حول المكان باستخدام الخلايا القلم الكاره للماء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: منصة المسح الآلي التي استخدمت في هذا البروتوكول، والتي تحتوي على ماسح ضوئي آلي متصل بمجهر فلوري.

Figure 3
الشكل 3: قائمة لإعداد الشرائح. افتح الحوار بالنقر فوق الزر SETUP في الشريط الجانبي. حدد أو أدخل الدليل المستهدف لملفات النتائج الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: قائمة إعداد المصنف. تأكد من تطابق إعدادات المصنف المحددة مع نوع الخلية الحالي وظروف التحضير وأنماط تلطيخ العينة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: قائمة الإعداد لنافذة البحث اليدوي. تم تحديد الإطار في إعداد الشريحة؛ سيفتح حوار يسمح بتحديد منطقة المسح الضوئي. باستخدام الهدف 10x، يتم تحديد منطقة البحث المستطيلة على الشريحة بشكل تفاعلي عن طريق إصلاح ركنين من حقل البحث عن طريق النقر الأيسر للفأرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: نافذة التحليل ، بمجرد الانتهاء من المسح الضوئي ، تظهر نافذة التحليل نتائج الفحص.

Figure 7
الشكل 7: عرض المعرض للشريحة المحددة. تم العثور على علامة التبويب معرض على الشريط الجانبي. يتكون معرض الصور من صور صغيرة للخلايا التي تم اكتشافها ، معروضة كصورة DAPI-TRITC مجتمعة. في الزاوية اليسرى والأي اليمنى السفلى من كل صورة يتم عرض عدد البؤر المباشرة وعدد البؤر المصححة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8:صور المدرج التكراري للشريحة المحددة. يتم فتح هذه النافذة عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الرسم البياني. بالنقر على الرسم البياني، توفر ورقة علامة التبويب المدرج التكراري ملخص بيانات يسرد متوسط الانحراف المعياري ومعامل التباين والقيم الدنيا والحد الأقصى والوسيط للخلايا التي تم تحليلها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: عدد بؤر γ-H2AX كدالة لجرعة الخلايا الليمفاوية المعرضة ل 60كو γ الأشعة. أشرطة الخطأ هي الانحرافات المعيارية التي تمثل التباين بين الجهات المانحة. وتمثل البيانات متوسط عدد بؤر γ-H2AX ± الانحراف المعياري لأربعة متطوعين أصحاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يصف هذا البروتوكول إجراء تدريجيا لتسجيل النقاط الآلي القائم على المجهر الفلوري لمقايس بؤر γ-H2AX. وهو يوضح فائدة فحص بؤر كوسيلة فعالة من حيث الوقت لتحليل عدد DSB الحمض النووي الناجم عن الإشعاع في الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي لإجراء تقييم الجرعة البيولوجية في سيناريو حادث الإشعاع حيث قد يتعرض الأفراد لمستويات غير معروفة من الأشعة تحت الحمراء.

وفي هذا البروتوكول المحدد، تم تشعيع مركبات ثنائي الفينيل متعددة البروم في المختبر لمحاكاة التعرض للإشعاع في الجسم الحي. بمجرد الانتهاء من التشعيع ووقت الحضانة لمدة ساعة واحدة ، يتم إجراء الشرائح باستخدام جهاز طرد مركزي للخلايا لإنشاء بقعة تركيز من الخلايا على الشريحة. استخدام جهاز الطرد الخلوي أمر حيوي لتحقيق شروط موحدة لتسجيل الآلي. عند الانتهاء، يتم استخدام قلم مسعور لجعل دائرة حول الخلايا، للحد من هدر الكواشف عن طريق السماح للمستخدم لترجمة الكواشف تلطيخ. يمكن استخدام هذا النوع من القلم في تقنيات مختلفة لاحتواء المناعة مثل أقسام البارافين والأقسام المجمدة ومستحضرات علم الخلايا. وعلاوة على ذلك، من المهم اختيار قلم مسعور متوافق مع أنظمة الكشف القائمة على الإنزيم والفلورسنت. بعد إعداد الشريحة ، حدث التثبيت والفلورة المناعية γ-H2AX. في هذا البروتوكول، يتم إصلاح الخلايا باستخدام 3٪ PFA في حل PBS لمدة 20 دقيقة. ولكي ينجح الاحتواء المناعي، من الضروري الاحتفاظ بمورفولوجيا الخلايا وأن تكون المواقع المضادة للجينات في متناول كاشفات الكشف المستخدمة. PFA هو عامل لطيف نسبيا لتثبيت واستقرار الخلايا مع الحفاظ على هياكل البروتين51. أدت تجارب التحسين مع تركيزات PFA أعلى وأوقات تثبيت أطول في تأثير سلبي على جودة الشريحة، ولكن المزيد من التخزين (بين عشية وضحاها) في 0.5٪ PFA تصل إلى 24 ساعة أسفرت عن نتائج جيدة.

الأجسام المضادة الأولية، 2F3 أحادية النسيلة المستخدمة في هذا البروتوكول يتفاعل مع البديل الهستون H2AX عندما الفوسفور في سيرين 139 بعد التعريفي DSB الحمض النووي. الأجسام المضادة قادرة على ربط بقايا الفوسفور مع عدم وجود التفاعل مع غيرها من histones الفوسفورية52. وبما أن هذا جسم مضاد أحادي النسيلة للفأر الأساسي، فقد تم اختيار جسم مضاد ثانوي ضد الأنواع المضيفة للأجسام المضادة الأولية أثناء تربيته في مضيف بديل، وهو الحمار المضاد للفأرة (DAM)-TRITC. في حين أن تلطيخ immunofluorescent يستند إلى ربط الأجسام المضادة محددة epitope، يمكن أن تؤدي العديد من القوى بين الجزيئيات أيضا في تلطيخ الخلفية غير محددة. من أجل الحد من الربط غير محددة، من المهم استخدام كاشف منع في بروتوكولات تلطيخ immunofluorescent53؛ استخدمنا حل BSA. وعلاوة على ذلك، ينبغي تخصيص وقت كاف لهذه الخطوة حظر عن طريق ترك الشرائح في الحل لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل تلطيخ الأجسام المضادة الأولية والثانوية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب استخدام محلول BSA كمثانة للأجسام المضادة الأولية والثانوية. اعتمادا على المضادة γ-H2AX والأجسام المضادة الثانوية التي تستخدم لتلطيخ, ينبغي للمرء أن تنظر في اختبار مختلف تمييع الأجسام المضادة من أجل تحديد التركيز الأمثل. لتسجيل أكثر دقة، يمكن إجراء تلطيخ مزدوج، عن طريق إضافة الحمض النووي DSB إضافية إصلاح الأجسام المضادة للبروتين.

ومن العيوب الرئيسية لهذا النوع من التحليل الحاجة إلى الحصول على عينات الدم في أقرب وقت ممكن بعد التعرض، حيث من المعروف أن الحد الأقصى لعدد البؤر ينخفض مرة أخرى إلى المستويات الطبيعية في غضون 48 ساعة بعد التشعيع. لذلك، عندما يعرف وقت وقوع حادث إشعاعي وأخذ عينات الدم اللاحقة، قد يكون من المفيد العمل مع منحنيات معايرة مختلفة تم تحديدها في نقاط زمنية مختلفة بعد التشعيع في المختبر (على سبيل المثال، 4 و8 و12 و24 ساعة). ومع ذلك، وكما سبق ذكره في قسم مقدمة المخطوطة، تكمن قوة المقايسة البؤرية γ-H2AX في أغراض الفرز الأولي والسريع وينبغي استخدامها لتحديد أولويات قياس الجرعات البيولوجية الجينية الخلوية الأكثر استهلاكا للوقت. سيناريو مشترك حيث يتم استخدام المؤشرات الحيوية متعددة قياس الجرعات الحيوية بالتوازي، وسوف تولد تقدير الجرعة الأكثر موثوقية ومختلف مختبرات قياس الجرعات الحيوية في جميع أنحاء العالم قد تضافرت جهودها لإنشاء شبكات على الصعيد الوطني التي يمكن تفعيلها واستخدامها للسماح تقييمات متعددة، محاكاة حيوية موازية من قبل مختبرات ذات خبرة مختلفة37،54،55 . بالإضافة إلى ذلك ، لا تزال التطورات جارية لتحليل فائق السرعة مثل مختبر متنقل في أو بالقرب من موقع الحادث56. ويجري باستمرار تطوير أساليب جديدة واعدة لقياس الجرعات الحيوية، مما سيؤدي إلى إنتاجية أسرع وأكثر موثوقية في المستقبل57.

بالنسبة لنظام تحليل الصور التلقائي، يتم إدخال الشرائح أو وضعها على منصة المسح الآلي أو مرحلة الشريحة. بعد ذلك، قم بتسمية تفاصيل الشريحة وحفظها في المجلد المناسب على الكمبيوتر المرفق. لهذه التجربة، يستند الكشف الآلي عن النوى والمفتوح على إعدادات المصنف المعنية. عند إنشاء مصنف، تأكد من تطابق إعدادات المصنف المحددة مع نوع الخلية الحالي وظروف التحضير وتلطيخ العينة immunofluorescent. يتم تعيين قنوات الفلورسنت المناسبة مطابقة الطيف الإثارة من الأجسام المضادة الأولية والثانوية في المصنف. يسمح المصنف بوضع معلمات تسجيل إضافية إذا لزم الأمر (على سبيل المثال، حجم النواة، كثافة الفلورسنت، كما هو موضح في القسم 6.1). إذا تم الجمع بين اثنين أو أكثر من بروتينات إصلاح الحمض النووي (على سبيل المثال، γ-H2AX و 53BP1) في تجربة، فإن النظام قادر أيضا على اكتشاف التوطين المشترك للإشارات. أولا، يكتسب النظام صور DAPI، ويطبق معالجة الصور، ويحدد النوى باستخدام المعايير المورفولوجية المحددة في المصنف. يتم الحصول على إشارات TRITC باستخدام 10 z-مداخن مع حجم خطوة من 0.35 مم بين الطائرات المحورية47. استخدم المصنف عدد البؤر المباشر ، حيث يتم تسجيل عدد إشارات TRITC المتميزة داخل النواة. وهنا، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أنه مع زيادة جرعة الإشعاع، تميل إشارات البؤر إلى الاندماج في أجسام أكبر، مما يؤدي إلى التقليل من شأن عدد البؤر الفعلي إذا تم حساب الأجسام مباشرة. لم يكن مطلوبا للتحليل الموضح هنا، ولكن يمكن تنفيذ خطوة إضافية مع تصحيح عدد Foci لحل هذه المشكلة. هذا الأخير يسمح للنظام للحصول على أحجام الإشارات المكتشفة ويزن لهم وفقا لذلك. يمكن استخدام كل من طرق العد توفير تقدير أكثر واقعية من العدد الفعلي لل البؤر بجرعات أعلى.

لبدء المسح الآلي، يتم تحديد منطقة المسح باستخدام الهدف 10x من المجهر لجعل منطقة البحث مستطيلة عن طريق تحديد ركنين من أركان حقل البحث عن طريق النقر الأيسر من الماوس (الشكل 5) ، متبوعا بتركيز موضع البداية. يتم تحديد الكائن المرجعي تلقائيا، ويطالب البرنامج المستخدم بالتركيز على نواة مرجعية (باستخدام الهدف 40x) لكل شريحة وتوسيطها. بعد بدء البحث، سينتقل النظام إلى مركز نافذة البحث في الشريحة المحددة الأولى وسيطلب توسيط وتركيز الكائن المرجعي. سيتم استخدام هذا الكائن لاحقا كمرجع موضع لتصحيح أي إزاحة في موضع الخلية. الغرض الثاني من الحقل المرجعي هو ضبط الضوء التلقائي ، في وضع الضوء المرسل يتم ضبط الضوء حتى يتم الوصول إلى مستوى الضوء الأمثل. في وضع الفلورسينس يتم إصلاح مستوى الضوء، ولكن يمكن زيادة وقت تكامل كاميرا CCD حتى يتم قياس الإشارة المطلوبة. لتمكين ضبط الضوء الصحيح، يجب أن يحتوي المرجع على كائنات ذات تلطيخ نموذجي. من المهم عدم استخدام حقل يحتوي على قطع أثرية ذات كثافة تلطيخ عالية جدا. بعد ضبط الضوء، يبدأ النظام التركيز البؤري التلقائي للشبكة في موضع الشبكة الأقرب إلى الحقل المرجعي. وهي تواصل تركيز الحقول على شبكة منتظمة، وتتحرك في تعرج نحو الجزء الأمامي والخلف من نافذة البحث. يبدأ المسح الضوئي عند اكتمال التركيز البؤري التلقائي للشبكة. يتم نقل المرحلة في حقل نمط تعرج بعد حقل لالتقاط البيانات. عند اكتشاف خلية، يتم تخزين موضعها وصورة المعرض وعرضها على الشاشة ويتم تحديث عدد الخلايا. في حالة حدوث خطأ في المجهر أو المرحلة أو وحدة التغذية، يتم إلغاء البحث تلقائيا. الخطوة الوحيدة التي يوجد فيها تدخل يدوي من المشغل، هي أثناء إعداد مسح الشرائح. هذه هي أيضا النقطة التي يتم فيها فحص مراقبة الجودة السريع (فقاعات الهواء ، أرقام الخلايا المنخفضة ، تلاشي القطع الأثرية لتلطيخ الإشارات الفلورية) وحيث يمكن أن يتقرر إجهاض مسح شريحة ذات جودة رديئة. يتم إنهاء البحث إذا تم مسح الشريحة بأكملها ضوئيا، أو إذا تم الوصول إلى الحد الأقصى لعدد الخلايا، أو إذا تم إلغاء البحث. بمجرد الانتهاء من المسح الضوئي ، يتم تقديم البيانات كما رأينا في الشكل 6. لعرض الخلايا الممسوحة ضوئيا، يتم فتح نافذة المعرض ويمكن عرض كل خلية (الشكل 7). هذه نقطة أخرى حيث يمكن للمشغل إجراء مراقبة الجودة عن طريق التحقق من تركيز صور المعرض والعدد الإجمالي للخلايا التي تم تسجيلها. إذا كان هناك عدد كبير جدا من الخلايا خارج التركيز أو تم الكشف عن خلايا قليلة جدا من قبل النظام لإجراء تقدير جرعة واقعية (على سبيل المثال، 100 خلية بدلا من الخلايا 1000 المقصود)، ثم ينبغي اتخاذ قرار لاستبعاد الشريحة والنتيجة التلقائية من التقييم النهائي. يتم تلخيص جميع البيانات في المدرجات التكرارية (الشكل 8) ، إلى جانب معلومات حول التوزيع والوسائل والانحراف المعياري لل البؤر المسجلة لكل خلية. ويمكن أيضا استخدام المدرجات التكرارية لاختيار وعرض مجموعات فرعية من النوى استنادا إلى النتائج الآلية للمراجعة. يتم إجراء التحليلات الإحصائية على النتائج بعد التوزيع، المتوسط، وقد تم تسجيل الانحراف المعياري للرقم البؤر لكل خلية يدويا. يمكن استخدام الرسم البياني كمنحنى معايرة لإجراء تقدير الجرعة لعينة قياس الجرعات الحيوية. ويمكن القيام بذلك باستخدام معادلة خط الاتجاه لإجراء تقدير تقريبي للجرعة المتلقاة. علاوة على ذلك الشكل 9 يوضح أن المسح الآلي حساس بما يكفي للكشف عن البؤر الناجمة بجرعات منخفضة. وعلاوة على ذلك، تظهر النتائج زيادة خطية واضحة لعدد البؤر لكل خلية مع الجرعة. وتجدر الإشارة إلى أن النتائج هي ممثل فقط للمصنف المستخدمة، وسوف تختلف النتائج لمعلمات مصنف مختلفة. لذلك، في حالة تحليل قياس الجرعات الحيوية، من المهم أن يتم استخدام نفس المصنف وإعداد الشريحة لعينات قياس الجرعة الحيوية مثل تلك التي تم استخدامها لإنشاء منحنى المعايرة الذي يستخدم لأداء تقدير الجرعة. في حين أنه كان خارج نطاق هذه الدراسة، من المهم أن نلاحظ أن γ-H2AX foci المقايسة يمكن أن تستخدم أيضا لتحديد تشعيع الجسم الجزئي. معظم التعرضات العرضية للإشعاع هي التعرض غير المتجانس أو الجزئي للجسم، حيث لم تتلق سوى منطقة محلية من الجسم جرعة عالية من التعرض. أوضحت العديد من الدراسات أنه من الممكن استخدام γ-H2AX foci تقدير جزء الجسم الذي تم تشعيعه والجرعة إلى الكسر المشعع42. عندما يحدث تشعيع كامل الجسم ، سيكون هناك تحريض عشوائي من الحمض النووي DSB في جميع الخلايا ويمكن للمرء أن يتوقع العثور على توزيع بواسون. على غرار الطرق الخلوية حيث يميل تحريض الانحرافات الكروموسومية إلى أن يكون أكثر من مشتتة في الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي حيث توجد وفرة عالية من الخلايا مع انحرافات متعددة وخلايا مع metaphases العادية ، وتحليل تشتت بؤر γ H2AX باستخدام طريقة بواسون الملوثة المقترحة على توزيعات بؤر متفرقة58. وتأكد أيضا أن هذا الأخير في in vivo تجارب مع الخنازير الصغيرة والمكاك ريسوس59.

Disclosures

س. شونك هو موظف في شركة ميتا سيستمز هارد آند سوفتوير غمب، ألتلوشيم، ألمانيا.

Acknowledgments

ويود المؤلفون أن يشكروا المشاركين في الدراسة على تبرعاتهم بالدم، وكذلك الممرضة ف. برنس على جمع عينات الدم. 12- ويعترف بموجب هذا بالمساعدة المالية المقدمة من مؤسسة البحوث الوطنية لجنوب أفريقيا في هذا البحث. والآراء التي أعرب عنها والاستنتاجات التي تم التوصل إليها هي آراء أصحاب البلاغ ولا تنسب بالضرورة إلى الصندوق الوطني لرعاية المسنين. وقد دعم هذا العمل ماليا الوكالة الدولية للطاقة الذرية، من خلال مشروع للتعاون التقني (رقم: URU6042) لدعم و. مارتينيز لوبيز، فضلا عن مشروع البحوث المنسقة E35010 (رقم العقد: 22248).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin - BSA Merck A3059
Coplin Jar Sigma S6016
Cover Slips (Size 24 x 50 mm) Lasec Glass2C29M2450Rec
Cryogenic Vials (1.2 mL) WhiteSci 607101
Cytospin Healthcare Technologies JC370-12-L
Cytospin Clips Healthcare Technologies JC302
Cytospin filter cards Healthcare Technologies JC307
Cytospin Funnels Healthcare Technologies JC372
DAM-TRITC Invitrogen A16022
DAPI-Fluroshield Sigma/Merck F6057
Ethanol Kimix ETD901
Filter tips WhiteSci  200ul (312012) and 1000ul (313012)
Hydrochloric acid- HCl Merck
Histopaque Sigma/Merck 10771
lithium–heparin collection tubes The Scientific Group 367526
MetaSystems - Metafer Metasystems Azio Imager Z2: 195-041848
NaOH Merck 221465
NovoPen Leica Biosystems NCL-PEN
Paraformaldehyde Sigma/Merck 158127
Phosphate-buffered saline Tablets Separations SH30028,02
Pipettes WhiteSci P11037 and P1033 X-tra Clipped Corner Slides are clipped at 45° angles to help reduce glass breakage.
Purified anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody Biolegend 613402 / 100 μg
RPMI medium WhiteSci BE12-702F
Triton X-100 (Octoxinol 9) Sigma/Merck T-9284
Tubes (15ml) WhiteSci 601002
X-Tra adhesive slides – corner clipped SMM Technologies 3800200E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barnes, J. L., et al. Carcinogens and DNA damage. Biochemical Society Transactions. 46 (5), 1213-1224 (2018).
  2. Little, J. B. Radiation carcinogenesis. Carcinogenesis. 21 (3), 397-404 (2000).
  3. Barquinero, J. F., et al. Lessons from past radiation accidents: Critical review of methods addressed to individual dose assessment of potentially exposed people and integration with medical assessment. Environment International. 146, 106175 (2021).
  4. International Atomic Energy Agency. Radiotherapy in Cancer Care: Facing The Global Challenge. International Atomic Energy Agency. , IAEA. Vienna. (2017).
  5. Achel, D. G., et al. Towards establishing capacity for biological dosimetry at Ghana Atomic Energy commission. Genome Integrity. 7 (1), 1-5 (2016).
  6. Sullivan, J. M., et al. Assessment of biodosimetry methods for a mass-casualty radiological incident: Medical response and management considerations. Health Physics. 105 (6), 540-554 (2013).
  7. Rea, M. E., et al. Proposed triage categories for large-scale radiation incidents using high-accuracy biodosimetry methods. Health Physics. 98 (2), 136-144 (2010).
  8. Swartz, H. M., et al. A critical assessment of biodosimetry methods for large-scale incidents. Health Physics. 98 (2), 95-108 (2010).
  9. International Atomic Energy Agency. Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies. International Atomic Energy Agency. , IAEA. Vienna. (2011).
  10. Grégoire, E., et al. Twenty years of FISH-based translocation analysis for retrospective ionizing radiation biodosimetry. International Journal of Radiation Biology. 94 (3), 248-258 (2018).
  11. Moroni, M., et al. Evaluation of the gamma-H2AX assay for radiation biodosimetry in a swine model. International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14119-14135 (2013).
  12. Rothkamm, K., et al. Laboratory Intercomparison on the γ-H2AX Foci Assay. Radiation Research. 180 (2), 149 (2013).
  13. Barnard, S., et al. The first gamma-H2AX biodosimetry intercomparison exercise of the developing european biodosimetry network RENEB. Radiation Protection Dosimetry. 164 (3), 265-270 (2015).
  14. Moquet, J., et al. The second gamma-H2AX assay inter-comparison exercise carried out in the framework of the European biodosimetry network (RENEB). International Journal of Radiation Biology. 93 (1), 58-64 (2017).
  15. Vinnikov, V., et al. Clinical Applications of Biomarkers of Radiation Exposure: Limitations and Possible Solutions Through Coordinated Research. Radiation Protection Dosimetry. 186 (1), 3-8 (2019).
  16. Mariotti, L. G., et al. Use of the γ-H2AX assay to investigate DNA repair dynamics following multiple radiation exposures. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
  17. Ivashkevich, A. N., et al. γH2AX foci as a measure of DNA damage: A computational approach to automatic analysis. Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 711 (1-2), 49-60 (2011).
  18. Rogakou, E. P., et al. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. Journal of Cell Biology. 146 (5), 905-915 (1999).
  19. Sedelnikova, O. A., et al. Quantitative Detection of 125 IdU-Induced DNA Double-Strand Breaks with γ-H2AX Antibody. Radiation Research. 158 (4), 486-492 (2002).
  20. Han, J., et al. Quantitative analysis reveals asynchronous and more than DSB-associated histone H2AX phosphorylation after exposure to ionizing radiation. Radiation Research. 165 (3), 283-292 (2006).
  21. Jaworska, A., et al. Operational guidance for radiation emergency response organisations in Europe for using biodosimetric tools developed in EU multibiodose project. Radiation Protection Dosimetry. 164 (1-2), 165-169 (2015).
  22. Kulka, U., et al. Realising the european network of biodosimetry RENEB - status quo. Radiation protection dosimetry. 164 (1), 42-45 (2015).
  23. Sánchez-Flores, M., et al. γH2AX assay as DNA damage biomarker for human population studies: Defining experimental conditions. Toxicological Sciences. 144 (2), 406-413 (2015).
  24. Raavi, V., et al. Potential application of γ-H2AX as a biodosimetry tool for radiation triage. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 787, 108350 (2020).
  25. Lassmann, M., et al. In vivo formation of γ-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
  26. Vandevoorde, C., et al. γ-H2AX foci as in vivo effect biomarker in children emphasize the importance to minimize x-ray doses in paediatric CT imaging. European Radiology. 25 (3), 800-811 (2015).
  27. Beels, L., et al. γ-H2AX foci as a biomarker for patient X-ray exposure in pediatric cardiac catheterization: Are we underestimating radiation risks. Circulation. 120 (19), 1903-1909 (2009).
  28. Bogdanova, N. V., et al. Persistent DNA double-strand breaks after repeated diagnostic CT scans in breast epithelial cells and lymphocytes. Frontiers in Oncology. 11, 1-14 (2021).
  29. Schumann, S., et al. DNA damage in blood leukocytes of prostate cancer patients undergoing PET/CT examinations with [68Ga]Ga-psma. Cancers. 12 (2), 1-14 (2020).
  30. Ivashkevich, A., et al. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
  31. Moquet, J., et al. Gamma-H2AX biodosimetry for use in large scale radiation incidents: Comparison of a rapid "96 well lyse/fix" protocol with a routine method. PeerJ. 2014 (1), 1-11 (2014).
  32. Turner, H. C., et al. Adapting the γ-H2AX Assay for Automated Processing in Human Lymphocytes. Radiation Research. 175 (3), 282-290 (2008).
  33. Sharma, P. M., et al. High Throughput Measurement of γ H2AX DSB Repair Kinetics in a Healthy Human Population. PLoS ONE. 10 (3), 0121083 (2015).
  34. Vandevoorde, C., et al. EPI-CT: In vitro assessment of the applicability of the γ-H2AX-foci assay as cellular biomarker for exposure in a multicentre study of children in diagnostic radiology. International Journal of Radiation Biology. 91 (8), 653-663 (2015).
  35. MacPhail, S. H., et al. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: Reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiation Research. 159 (6), 759-767 (2003).
  36. Barnard, S., et al. The shape of the radiation dose response for DNA double-strand break induction and repair. Genome Integrity. 4 (1), 1 (2013).
  37. Kulka, U., et al. Biodosimetry and biodosimetry networks for managing radiation emergency. Radiation Protection Dosimetry. 182 (1), 128-138 (2018).
  38. Macaeva, E., et al. Gene expression-based biodosimetry for radiological incidents: assessment of dose and time after radiation exposure. International Journal of Radiation Biology. 95 (1), 64-75 (2018).
  39. Khanna, K. K., et al. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
  40. Rothkamm, K., et al. γ-H2AX as protein biomarker for radiation exposure. Annali dell'Istituto Superiore di Sanita. 45 (3), 265-271 (2009).
  41. Borràs, M., et al. Comparison of methods to quantify histone H2AX phosphorylation and its usefulness for prediction of radiosensitivity. International Journal of Radiation Biology. 91 (12), 915-924 (2015).
  42. Horn, S., et al. Gamma-H2AX-based dose estimation for whole and partial body radiation exposure. PLoS ONE. 6 (9), 1-8 (2011).
  43. Costes, S. V., et al. Imaging Features that Discriminate between Foci Induced by High- and Low-LET Radiation in Human Fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
  44. Leatherbarrow, E. L., et al. Induction and quantification of γ-H2AX foci following low and high LET-irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (2), 111-118 (2006).
  45. Mistrik, M., et al. Low-dose DNA damage and replication stress responses quantified by optimized automated single-cell image analysis. Cell Cycle. 8 (16), 2592-2599 (2009).
  46. Oeck, S., et al. The Focinator - a new open-source tool for high-throughput foci evaluation of DNA damage. Radiation Oncology. 10 (1), 1-11 (2015).
  47. Vandersickel, V., et al. Early increase of radiation-induced γH2AX foci in a humanku70/80 knockdown cell line characterized by an enhanced radiosensitivity. Journal of Radiation Research. 51 (6), 633-641 (2010).
  48. Sambrook, J., et al. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
  49. Rifai, A., et al. B and T lumphocytes. Recent Advances in IgA Nephropathy. (6), 193-210 (2009).
  50. Andreo, P., et al. Absorbed dose determination in external beam radiotherapy: An international code of practice for dosimetry based on absorbed dose to water. International Atomic Energy Agency. , Technical Report Series No. 398 (2001).
  51. Jamur, M. C., et al. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
  52. Rogakou, E. P., et al. DNA Double-stranded Breaks Induce DNA Double-stranded Breaks Induce Histone H2AX Phosphorylation on Serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 1-12 (1998).
  53. Kyuseok, I. An introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  54. Ainsbury, E. A., et al. Multibiodose radiation emergency triage categorization software. Health Physics. 107 (1), 83-89 (2014).
  55. Ainsbury, E. A., et al. Dose estimation software for radiation biodosimetry. Health Physics. 98 (2), 290-295 (2010).
  56. Turner, H. C., et al. The RABiT: High-throughput technology for assessing global DSB repair. Radiation and Environmental Biophysics. 53 (2), 265-272 (2014).
  57. Wang, Q., et al. Development of the FAST-DOSE assay system for high-throughput biodosimetry and radiation triage. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
  58. Rothkamm, K., et al. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: A quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
  59. Redon, C. E., et al. an analysis method for partial-body radiation exposure using γ-H2AX in nonhuman primate lymphocytes. Radiation Measurements. 46 (9), 877-881 (2011).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 178،
طريقة تسجيل مجهرية آلية لإجراء فحص foci γ-H2AX في الخلايا الليمفاوية الطرفية للدم البشري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nair, S., Cairncross, S., Miles, X., … More

Nair, S., Cairncross, S., Miles, X., Engelbrecht, M., du Plessis, P., Bolcaen, J., Fisher, R., Ndimba, R., Cunningham, C., Martínez-López, W., Schunck, C., Vandevoorde, C. An Automated Microscopic Scoring Method for the γ-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes. J. Vis. Exp. (178), e62623, doi:10.3791/62623 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter