Summary
在本手稿中，我们描述了一个简单的方法的生长，纯化和滴定肿瘤疱疹简单病毒的药物前使用。
Abstract
肿瘤病毒（OVs），如肿瘤疱疹单纯病毒（oHSV），是癌症免疫治疗领域快速增长的治疗策略。OVs，包括oHSV，有选择地复制和杀死癌细胞（拯救健康/正常细胞），同时诱导抗肿瘤免疫。由于这些独特的特性，基于 oHSV 的治疗策略越来越多地用于癌症的治疗，临床前和临床上，包括 FDA 批准的塔利莫金·拉赫帕雷韦克 （T-Vec）。生长、纯化和滴定是任何 OEV（包括 oHSV）的三种基本实验室技术，在它们可用于实验研究之前。本文描述了一个简单的分步方法来放大维罗细胞中的 oHSV。当 oHSV 成倍增加时，它们在 Vero 细胞中产生细胞病变效应 （CPE）。一旦90-100%的受感染细胞显示CPE，它们就会被轻轻收获，用苯甲酸酯和氯化镁（MgCl2）进行处理，过滤后，使用蔗糖梯度法进行净化。净化后，传染性 oHSV（指定为斑块形成单位或 PPF）的数量由 Vero 细胞中的"斑块检测"确定。此处描述的协议可用于为细胞培养和体内动物实验的体外研究准备高滴度 oHSV 库存。
Introduction
肿瘤病毒（OVs）是癌症免疫治疗的一种新兴和独特的形式。OVs有选择地复制和解毒肿瘤细胞（备用正常/健康细胞）1，同时诱导抗肿瘤免疫2。单纯疱疹病毒（oHSV）是所有OV中研究最广泛的病毒之一。这是最远的沿诊所， 与塔利莫金拉赫帕雷普韦克 （T-VEC） 是第一个也是唯一的 OV 获得 FDA 批准在美国治疗晚期黑色素瘤3.除了T-VEC，许多其他基因工程的oHSV正在临床和临床上测试不同的癌症类型3，4，5，6，7，8。目前先进的重组DNA生物技术进一步增加了工程新oHSV编码治疗转基因的可行性。在任何（新开发的）oHSV能够进行体外和体内研究测试之前，有效的 oHSV 传播、纯化和滴定测定系统至关重要。本文描述了一个简单的分步方法（在维罗细胞中）、纯化（通过蔗糖梯度法）和滴定（通过在维罗细胞中的 oHSV 斑块检测）（图 1）。它可以很容易地在任何生物安全级别 2 （BSL2） 实验室设置中采用，以实现高品质的病毒库存，用于前科研究。
维罗，非洲绿猴肾细胞系，是最常见的细胞系为oHSV传播9，10，11，12，13，因为维罗细胞有一个有缺陷的抗病毒干扰素信号通路14。其他具有干扰素基因（STING）信号的灭活刺激器的细胞系也可用于oHSV增长12，13。此协议利用 Vero 细胞进行 oHSV 生长和斑块检测。繁殖后，oHSV感染的细胞被收获、解毒并接受净化，其中被浸渍细胞首先用苯甲酶核酶处理，以降解宿主细胞DNA，防止核酸蛋白聚集，降低细胞的粘度。由于适当激活苯甲酶通常需要毫克2+，1-2 mm MgCl2用于此协议15。在高速蔗糖梯度离心之前，通过连续过滤进一步消除苯甲酸酯处理细胞裂解物中的宿主细胞碎片。粘性25%蔗糖溶液垫有助于确保通过蔗糖层的病毒迁移速度更慢，将宿主细胞相关成分留在超自然体内，从而改善净化和限制颗粒16中的病毒损失。净化的 oHSV 然后滴定在 Vero 细胞上，病毒斑块通过 Giemsa 染色17或 X gal 染色（用于 LacZ 编码 oHSV）18来可视化。
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Protocol
1） 奥赫斯夫增长
注：在与 oHSV 合作之前，确保机构生物安全委员会的批准。这项研究是根据经核准的IBC第18007号议定书进行的。保持BSL2预防措施：漂白所有与病毒接触的管道、尖端、管子和其他材料。在手离开BSL2细胞培养罩之前，用70%异丙醇喷洒手套。使用病毒后，始终用肥皂水彻底洗手。
- 在第 -1 天，种子低通道 Vero 细胞在 20 T-150 厘米2 烧瓶密度为 7-8 × 106 细胞/烧瓶在常规 Vero 细胞介质。
注：Vero介质是通过补充杜尔贝科的改良鹰介质 （DMEM） 与 10% 热灭活胎儿小牛血清 （IFCS） 来制备的。 - 在第 0 天（细胞是 80-90% 的汇合体），在 Vero 细胞上添加 oHSV 内产。
- 病毒接种准备
- 使用 0.01 的多种感染 （MOI 可以根据病毒的复制能力从 0.01 到 0.1 不等） 进行病毒放大。使用公式（1）计算 20 个烧瓶的病毒 （mL） 量。
20 个烧瓶的病毒量 （mL） = 所需的病毒量 （pfu） / 病毒库存量 （pfu/mL）（1） - 使用高葡萄糖杜尔贝科的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 补充 1% IFCS 来准备病毒接种 （7 mL 每 T-150 厘米2 瓶， 即 ~140 mL 20 瓶）.将所需的 oHSV 量添加到 140 毫升高葡萄糖 DPBS/1% IFCS 溶液中，涡流 1 分钟，并保持混合物的准备，以加入 Vero 细胞。
- 使用 0.01 的多种感染 （MOI 可以根据病毒的复制能力从 0.01 到 0.1 不等） 进行病毒放大。使用公式（1）计算 20 个烧瓶的病毒 （mL） 量。
- 清洗T-150厘米2 烧瓶2倍，高葡萄糖DPBS补充1%IFCS（10mL/洗涤）。吸气 DPBS/1% IFCS，并添加 7 mL 的病毒接种/T-150 厘米2 瓶。
- 使用烧瓶摇动器在 Vero 单层上轻轻摇动烧瓶 5 分钟，以适当分配无菌层，然后在 37 °C 的 1.5-2 h 下孵育烧瓶。确保孵化器架子处于水平。
- 去除接种，并添加DMEM补充1%IFCS（25 mL/烧瓶）。孵化烧瓶2-4天。
- 病毒接种准备
- 每天检查烧瓶90-100%CPE（见图2）。
- 收获受奥赫斯夫感染的维罗细胞。
- 从每个烧瓶中收集培养超标剂（~20 mL）（每个烧瓶中留出~5毫升）在50 mL锥形离心机管或介质容器中。
- 使用细胞刮刀轻轻地从烧瓶底部刮出细胞。
注意：细胞应该迅速脱落烧瓶。 - 在每个烧瓶中加入约 15 mL 的文化超标（以步骤 1.4.1 收集）（每个烧瓶的体积为 ~20 mL，即 20 个烧瓶的 400 mL），然后使用 10 mL 无菌血清管轻轻清洗烧瓶底部几次。
注意： 不要 用力吹笛。旨在保持所有细胞完好无损。 - 将细胞（+中等）收集到冰上50mL锥形离心管中（使用8个管子从20个烧瓶中容纳400mL的收获细胞）。
- 在 300 克 的 4 °C 下旋转细胞 10 分钟，并吸气超自然人。
- 添加 1.25 mL （50%）病毒缓冲区 （VB） 和 1.25 mL （50%）将培养超母（以步骤 1.4.1 收集）到每个离心管，彻底重新悬浮每个颗粒。将重新悬浮的电池从8个50mL离心管转移到一个50mL锥形离心管。
注：请参阅 表1中 VB 解决方案的准备情况。使用介质灭菌过滤器对 VB 解决方案进行滤除。使用 0.5 mL 的 VB + 0.5 mL 的超标每 T-150 厘米2 瓶重新悬挂，即 20 个烧瓶 （20 mL），使用 10 mL 的 VB 和 10 mL 的文化超标。 - 使用干冰/100%乙醇将重新悬浮的细胞快速冷冻，并储存在 -80 °C。
2） 奥赫斯夫净化
- 捕捉冻结（在干冰和100%乙醇）/thaw（在37°C温水浴）细胞，然后水浴声波1分钟，共3个周期，以确保细胞的适当裂解释放病毒在超自然。
注：使用40 kHz、120 V功率执行1分钟的声波。如果不可调谐声波器不可用，请使用超声波水浴声波器。在第 3 节中使用 50μL 的报价进行滴定，这将有助于确定下一步中哪一个对净化过程中潜在的病毒损失负责。 - 用苯甲酸酯（175单位/mL）+2毫微克2（1M库存=2μL/mL）、涡流处理细胞水解，在37°C下孵育30分钟。 将管子放在冰上，并在 4 °C 处执行以下步骤。
- 通过低速离心将细胞碎片颗粒化。
- 将细胞的利萨酸盐在300 克 旋转10分钟。
- 在新的 50 mL 锥形离心管中收集超纳特（在 VB 的 0.5 mL 中重新悬浮细胞颗粒，将其指定为颗粒-1，并储存在 4 °C，用于步骤 2.3.5;见 图 1）。
- 在 500 克 处再次旋转超自然（在步骤 2.3.2 中获得）10 分钟。
- 在新的 50 mL 锥形离心管中收集超细剂（在 VB 的 0.5 mL 中重新悬浮细胞颗粒，将其指定为颗粒-2，并储存在 4 °C，用于步骤 2.3.5;见 图 1）。
- 将重新悬浮的颗粒-1（从2.3.2）和颗粒-2（从2.3.4）混合到新的1.7 mL离心机管中，涡流/声波（水浴）2次，在400克处旋转10分钟。收集超自然人，并将其与步骤 2.3.4 中获得的超自然人相结合：见图1）。
注意：使用 40 kHz、120 V 功率执行声波 1 分钟，以防止病毒聚集，然后在第 2.4 步的过滤过程之前。在第 3 节中，以组合超自然体的 50μL 等号进行滴定。
- 使用以下 3 步过滤方法，从 1.4.6、0.5 mL 到 2.3.2 和 0.5 mL 过滤组合超自然剂（~21 mL，即 20 mL）。
- 使用 10 mL 注射器（每次 5-7 mL，方便通过过滤器）绘制 21 mL 的超自然分子，并通过放置在新的 50 mL 锥形离心管（标记为 TUBE 1）上的无菌 5μm 聚乙烯二氟化物膜过滤器将其传递。
- 将 1 mL VB 添加到 2.4.1 中清空的 50 mL 锥形离心管（以收集病毒超自然体的剩余微量）、涡流，并通过放置在 TUBE 1 上的相同 5μm PVDF 过滤器（使过滤率达到 22 mL）。继续步骤 2.4.2。
- 从 TUBE 1 中抽取 22 mL 的滤光板（如 2.4.1），并通过放置在新的 50 mL 圆锥离心机管（标记为 TUBE 2）上的无菌 0.8μm 混合纤维素酯 （MCE） 膜过滤器将其传递。
- 将 1 mL 的 VB 添加到第 2.4.2 步（漩涡）中清空的 TUBE 1 中，并通过放置在 TUBE 2 上的相同 0.8μm MCE 过滤器（使过滤率总计达到 23 mL）。继续步骤 2.4.3。
- 从 TUBE 2 中抽取 23 mL 的滤光片（如 2.4.1），并通过放置在新的 50 mL 圆锥形离心机管（标记为 TUBE 3）上的无菌 0.45 μm PVDF 过滤器将其传递。
- 将 1 mL 的 VB 添加到 第 2 步 2.4.3（漩涡）清空的 TUBE 2 中，并通过放置在 TUBE 3 上的相同 0.45 μm PVDF 过滤器（使过滤率总计达到 24 mL）。
注意：在第3节中，以过滤液的50μL单报价进行滴定。
- 将 1 mL 的 VB 添加到 第 2 步 2.4.3（漩涡）清空的 TUBE 2 中，并通过放置在 TUBE 3 上的相同 0.45 μm PVDF 过滤器（使过滤率总计达到 24 mL）。
- 使用 10 mL 注射器（每次 5-7 mL，方便通过过滤器）绘制 21 mL 的超自然分子，并通过放置在新的 50 mL 锥形离心管（标记为 TUBE 1）上的无菌 5μm 聚乙烯二氟化物膜过滤器将其传递。
- 使用蔗糖梯度法的高速离心
注：此协议中使用了固定角度 F13-14x50cy 转子。转子和离心机在进行以下步骤之前都必须处于 4 °C。- 在新的 50 mL 圆锥离心机管中加入 10 mL 的冰冷无菌过滤 25% 蔗糖溶液（通过在 100 mL 的汉克平衡盐溶液中溶解 25 克蔗糖粉来制备）。
- 慢慢地（3 mL/min）在蔗糖层顶部添加24毫升的病毒过滤液（从步骤2.4.3.1获得）。注意保持病毒过滤和蔗糖溶液的单独层。
注：在蔗糖溶液的 10 mL 以上可添加高达 30 mL 的病毒层。 - 在 4 °C 下，在 22，620 克 时将管子离心 90 分钟。
- 从 50 mL 锥形离心机管中取出超自然和蔗糖层。
注：病毒颗粒应该是白的。以超自然人的 50μL 阿利报价和蔗糖层的 50μL 阿利报价在第 3 节进行滴定。
- 将颗粒重新悬浮在 10% 甘油/PBS 溶液中。
- 在 50 mL 锥形离心管中加入 1 mL 无菌 10% 甘油（在 PBS 中稀释），以覆盖颗粒。
注：重新悬浮的混合物的量可能因颗粒大小而异（如 0.8-1.2 mL）。较小的体积会使病毒浓度升高。 - 将50mL锥形离心机管放在冰上2-4小时。在此期间，每15分钟对颗粒进行声波/涡流30秒，以帮助分离/重新悬浮颗粒。
- 在 2 mL 微中枢管中收集重新悬浮的颗粒（1 mL 的 10% 甘油/PBS + 颗粒大小将使总体积达到 ±1.3 mL）。[可选：将另外 0.3 mL 的 10% 甘油/PBS 添加到同一个 50 mL 锥形离心管中，以收集颗粒的剩余微量，上下吹管，并结合步骤 2.6.3 中的重新悬浮颗粒，使总体积达到 ±1.6 mL。
- 如果步骤 2.6.3 中的悬架为浑浊或多云（由于细胞碎片），则将管子在 500 克 处离心 10 分钟，将超自然物转移到新的 2 mL 微中微富格管中，然后继续进行步骤 2.6.4。
- 在第3节中，以50μL的引用来表示oHSV滴定。将其余溶液（250μL/aliquot）加入无菌微中螺管（密封良好，用于长期存储）、快速冻结，并储存在-80°C，直到使用（一旦确定 oHSV 滴定器即可进行实验研究）。
注意：所有与病毒接触的材料在从引擎盖上取出或处置之前，必须漂白或用紫外线辐射进行处理。
- 在 50 mL 锥形离心管中加入 1 mL 无菌 10% 甘油（在 PBS 中稀释），以覆盖颗粒。
3. oHSV 滴定和斑块检测
- 种子 1.7-1.8 x 105 Vero 细胞/井在 6 井细胞培养板在 Vero 细胞介质 （DMEM 与 10% IFCS; 见步骤 1.1）.
注意：确保细胞均匀分布在整个井中：不要旋转板，这可能导致细胞在井中间的积累。为了防止旋转，用手垂直缓慢地摇动板，然后水平摇动板，然后轻轻地将板放在孵化器中。 - 第二天（当细胞达到70-80%的汇合度），吸气培养介质，并添加1mL/井的高葡萄糖PBS补充1%IFCS。将板留在细胞培养罩中，直到步骤 3.3 完成。
- 使用PBS/1%IFCS（图3）在5mL聚丙烯管中连续稀释病毒。
注：使用步骤 2.6.4 中收集的 50μL 别名用于串行稀释。在第1管（10-3稀释），添加2μL的病毒在1998年μL的PBS/1%IFCS，漩涡。在第二管（10-5稀释），采取10 μL从1管在990 μL的PBS/1%IFCS，漩涡。在第三管（10-6稀释），从第二管取100μL在900μL的PBS/1%IFCS，漩涡：继续此 10 倍串行稀释，直到 10-9稀释。请参阅图 3中的细节。 - 吸气PBS/1%IFCS，并添加0.7 mL/井的序列稀释病毒（从10-5 开始到10-9）到Vero细胞。
注意：不要让细胞干燥。 - 在室温下轻轻摇动摇动摇动板5分钟（确保病毒接种的均匀分布）。
- 在 37 °C 时将盘子孵化 1.5 小时。
注：在此潜伏期内，准备在DMEM中稀释1：1000人免疫球蛋白G（IgG），并辅以1%IFCS。对于 6 井板，准备 12.5 mL，以便 2 mL/井可用于步骤 3.7。调整稀释，以考虑人类IgG中的很多变化。 - 从井中去除病毒接种，并在 DMEM 中加入 2 毫升/井 0.1% 的人类 IgG（以中和培养介质中的 oHSV 并防止形成二次斑块），并辅以 1% 的 IFCS。在 37 °C 下孵化板 3-4 天。
注：清除斑块通常在3天内形成。 - 固定和染色板
- 去除超自然，将细胞固定在纯甲醇（1mL/井）中5分钟。去除甲醇，让盘子风干。
- 稀释吉姆萨污渍 （1：5） 与除离子水， 并添加 1 mL 的稀释吉姆萨污渍相关井.在室温下孵化盘子10-15分钟。
- 去除污渍，用自来水冲洗，让盘子空气干燥。
- 使用解剖显微镜数一数斑块。
- 带 lacZ 表达式的 oHSV 可选：
- 去除超标，并在室温下用冷0.2%的谷氨酸/2%副甲醛固定细胞5-10分钟。
- 取出固定溶液，用 PBS 清洗细胞 3 倍。
- 在细胞中加入 X gal 溶液（1 mL/井），并在 37 °C 下孵育板 2 小时。
注意：X gal 污渍应在染色当天新鲜准备：长期存储可能导致颜色褪色。请参阅 表 1中的 X gal 解决方案的准备情况。 - 取出 X gal 污渍，用自来水清洗盘子 1 分钟。
- 在室温下用中性红色溶液（1 mL/井）反污渍2分钟。
注：请参阅 表1中中性红色解决方案的准备。 - 用自来水清洗盘子1分钟：让盘子风干。
- 使用解剖显微镜数蓝色斑块（图4）。
- 使用公式计算滴定器 （2）
pfu/mL 中的滴定器（斑块成型单元） = 斑块数量/0.7 mL ×稀释因子（2）
注：例如，如果在10-9 稀释井中发现 25 个斑块，则滴定器为 25/0.7 × 109 = 35.7 × 109 = 3.57 ×10 10 pfu/mL。这是第 2.6.4 步准备的最后一个 ohsv 报价。
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Representative Results
图 1中描述了整个协议的简要概述，该图代表了 oHSV 的生长、净化和认证的关键步骤。Vero细胞中的CPE最早可检测到4小时后HSV感染19。图2在 oHSV 感染后的三个不同时间点演示 Vero 细胞中的 CPE。随着时间的推移，CPE 的水平会提高。在此协议中，90-100% CPE 通常在低 MOI oHSV 接种的 48 小时内观察到（这是收获细胞进行净化的最佳时机）。但是，根据第 1.2 步接种的 oHSV MOI 和/或 oHSV 的复制潜力，可能需要长达 4 天的时间。在此时期之后，CPE的细胞可以被解化，导致超自然分子中病毒的释放。因此，要获得高病毒滴定器，在受 CPE 影响的细胞完好无损时收获它们至关重要。导致最终病毒滴定的另一个重要因素是用于 oHSV 放大的组织培养烧瓶的数量或大小。图3描绘了通过斑块测定滴定所需的给定病毒存量（以步骤2.6.4获得）的序列稀释（10-3至10-9）的过程。对于具有lacZ表达的 oHSV，病毒斑块可以通过 X gal 染色（图 4）可可视化。在此协议中，使用了 20 个 T-150 厘米2组织培养烧瓶，其中 1.3-1.6 mL 的 oHSV 库存，其滴度为 1 × 1010 pfu/mL。
图1：在 oHSV 生长、净化和斑块检测中涉及的主要步骤的示意图演示。 缩写：oHSV =抗可体疱疹简单病毒;CPE = 细胞病变效果;VB =病毒缓冲区：HBSS = 汉克的平衡盐解决方案;PBS=磷酸盐缓冲盐水。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：oHSV感染后维罗细胞的细胞病变效应。 Vero细胞在 0.01 的 MOI 中接种了 mCherry 的 oHSV 编码（以红色荧光显示），在 36、48 和 72 h 病毒后感染时进行了成像（10 倍放大）。CPE 通过四舍五入感染 oHSV 的细胞（由黑箭头指示）进行识别。比例杆 =200 μm。缩写：oHSV=抗可解疱疹简单病毒。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：用于斑块测定的 oHSV 库存的连续稀释。另请参阅协议的第 3.3 步。缩写：oHSV=抗可解疱疹简单病毒。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：72 h 后 HSV 感染时 X-gal 染色斑块的代表性图像。未稀释（上井）和稀释（1：10;下井）oHSV感染的细胞培养超纳特添加到Vero细胞（70-80%汇合），其次是X-gal染色协议描述在第3.8.5节（不包括反染色与中性红色）。X-gal 染色病毒斑块（左面板）的代表图像呈现在中间（4 倍;比例杆 = 1000 μm）和右侧（10 倍;比例杆 = 200μm）面板中。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 解决方案组成 | |
| 病毒缓冲器的准备 | 数量 |
| 1 M 氯化钠 | 15升 |
| 1 M 三氢氯化物 | 3升 |
| 净化水 | 132毫升 |
| 将pH调整为6.8 | |
| 准备 X gal 解决方案（一个 6 井板的 6.5 mL） | |
| 250m 铁氰化钾 | 130 微升 |
| 250m 铁氰化钾 | 130 微升 |
| 1 M 氯化镁 | 13 微升 |
| X-gal 在二甲基硫氧化物 （DMSO） 中预溶解 （20 毫克/mL） | 162.5 微升 |
| PBS | 6064.5 微升 |
| 为一个 6 井板准备中性红色解决方案 | |
| 中性红色解决方案 | 100μL |
| 甲醇 | 1升 |
| 净化水 | 7升 |
表1：解决方案组成。
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Discussion
该协议从低通道维罗细胞中的 oHSV 生长开始。在病毒接种时，Vero细胞单层的对流应为+80%，因为过度生长的细胞可以发展出紧密的纤维结构，减少OHSV进入Vero细胞20。观察到 90-100% CPE 后，培养超自然体被去除，细胞被收获，在 VB/超自然剂中再悬浮（参见步骤 1.4.6），快速冷冻，并储存在 -80 °C 以供以后净化。Blaho和他的同事采用了一种略有不同的方法来采集和储存受感染的维罗细胞。例如，含有细胞和培养介质的烧瓶（辅以1%的牛血清白蛋白和PBS钾）最初储存在-80°C至少15分钟，然后在室温下缓慢加热烧瓶。然后，细胞被收获，与无菌牛奶混合，并储存在-80°C，直到纯化20。在这种情况下，无菌牛奶起到稳定剂的作用，并且证明，当病毒储存在无菌牛奶/中等中型牛奶中时，病毒储存的滴定器比仅在中等20中储存时要高得多。然而，在另一项研究中，用于储存几种疱疹病毒的不同稳定剂（包括无菌牛奶）之间的直接比较在-80 °C没有显示对最终病毒滴定器21的任何显著影响。在这里，细胞颗粒在VB中重新悬浮，由Tris-缓冲盐水（pH 6.8）和10%甘油组成，作为储存稳定剂，通常为实验研究提供高病毒滴定剂（如第3.10步所述）。
从重新悬浮的颗粒中去除所有细胞和介质相关组件以获得高质量的病毒库存至关重要。在体内实验中，去除非病毒颗粒对于避免潜在的免疫反应至关重要。已描述了几种病毒净化方法，包括离心22、不同梯度方法23、过滤24和亲和力色谱25。虽然这个协议是基于高速离心使用蔗糖梯度法，其他各种梯度方法已被其他人使用，如碘沙诺11，26，珀科尔27和菲科尔-尼科德兹23。这些梯度方法按密度将病毒分离，需要将带与梯度隔离，而不是病毒被放生处的蔗糖垫。蔗糖梯度方法提供了一种将病毒颗粒分离的温和方法，因为它最大限度地降低了破坏病毒包络蛋白的风险，同时保留了病毒感染性。尽管有这些优点，浓缩蔗糖溶液的高渗透性可能会使病毒颗粒脱水：因此，开发碘萨诺梯度法，以克服这一缺点。然而，碘萨诺梯度法需要超中性富集和收集病毒带。在 oHSV 净化过程中需要考虑的其他因素是离心的速度和时间以及用于长期存储的病毒缓冲器的选择。本协议的限制是，oHSV的纯度未得到确认：然而，通过对Vero细胞进行滴定，在给定纯化的oHSV库存中发现了大量功能性病毒颗粒（见第3节）。
oHSV在维罗细胞上形成斑块（图4）。病毒斑块可以通过Giemsa染色来识别，这是一种简单方便的方法。Giemsa 染色 Vero 细胞，使病毒斑块透明或空，可轻松可视化（肉眼），并使用解剖显微镜进行计数。虽然覆盖媒体与阿加罗斯或甲基纤维素是常用在斑块形成期间（在第3.7步），以防止病毒的传播和继发感染和斑块尾部28，使用人类IgG中和的oHSV在培养超自然是更容易和更方便的。对于表达 乳胶的 oHSV，斑块可以通过 X gal 染色（图 4）可视化，而荧光显微镜用于荧光蛋白（即绿色荧光蛋白）表达 oHSV18。检测 oHSV 感染细胞的其他检测包括免疫组织化学或荧光与 oHSV 特异性抗体29 或激光扫描近红外氟磷共化 oHSV 特异性抗体30。
必须采取一些关键措施，以达到良好的病毒存量，如保持不育，以防止微生物（细菌、酵母或霉菌）污染和健康的维罗细胞。由于 oHSV 的信封具有极高的发热量20，因此 oHSV 库存应以低温保护剂（如 10% 甘油）处理。总体而言，此协议可在实验室环境中轻松使用和实践，但可能对大规模病毒生产没有用处。
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Disclosures
SDR 是与可解疱疹简单病毒相关的专利的共同发明者，由乔治敦大学和马萨诸塞州总医院拥有和管理，这些医院已获得 Amgen 和 ActiVec 公司的专利使用费，并且是 EG 427 的科学咨询委员会成员。其他作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
萨哈实验室的研究部分得到了美国劳工部（W81XWH-20-1-0702）和道奇琼斯基金会-阿比林的资金支持。塞缪尔·拉布金和梅丽莎·汉弗莱.M部分得到国家卫生研究院（R01 CA160762）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
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