Summary
이 원고에서는, 우리는 전임상 사용을 위한 온연성 포진 심플렉스 바이러스의 성장, 정제 및 적정의 간단한 방법을 설명합니다.
Abstract
종양용성 포진 심플렉스 바이러스(oHSV)와 같은 종양용액 바이러스(OV)는 암 면역요법 분야에서 빠르게 성장하는 치료 전략이다. oHSV를 포함한 OV는 항종양 면역을 유도하면서 암세포(건강/정상 세포를 아끼는)를 선택적으로 복제하고 죽입니다. 이러한 독특한 특성 때문에, oHSV 기반 치료 전략은 점점 더 암의 치료에 사용되고있다, 전임상 및 임상적으로, FDA 승인 탈리모진 laherparevec을 포함 (T-Vec). 성장, 정제 및 적정은 실험 연구에 활용되기 전에 oHSV를 포함한 모든 TV에 필수적인 실험실 기술입니다. 이 백서는 베로 세포에서 oHSV를 증폭시키는 간단한 단계별 방법을 설명합니다. oHSV가 증식함에 따라 베로 세포에서 세포 병증 효과 (CPE)를 생성합니다. 감염된 세포의 90-100%가 CPE를 나타내면, 부드럽게 수확되고, 벤조나제와 염화마그네슘(MgCl2)으로처리되고, 여과하고, 자당그라데이션 방법을 사용하여 정제를 실시한다. 정제 후, 전염성 oHSV(플라크 형성 유닛 또는 PfUs로 지정)의 수는 베로 세포의 "플라크 분석"에 의해 결정된다. 본 명세서에 기재된 프로토콜은 세포 배양 및 생체 내 동물 실험에서 체외 연구를 위해 고-티터 oHSV 스톡을 준비하는 데 사용될 수 있다.
Introduction
종양 분석 바이러스 (EV)는 암 면역 요법의 신흥 독특한 형태입니다. OV는 항종양면역2를유도하면서 종양 세포(정상/건강한 세포를 아끼는)1에서 선택적으로 복제및 용해된다. 온코일리틱 포진 심플렉스 바이러스(oHSV)는 모든 TV 중에서 가장 광범위하게 연구된 바이러스 중 하나입니다. 탈리모진 래에르파렙벡(T-VEC)이 미국에서 고급 흑색종3의치료를 위한 FDA 승인을 받은 최초의 유일한 OV인 것으로, 클리닉에서 가장 멀리 있다. T-VEC 이외에, 다른 많은 유전자 조작 된 oHSV는 다른 암유형3,4,5,6,7,8에서전임상 및 임상적으로 테스트되고 있다. 현재 진행된 재조합 DNA 생명공학은 치료형 트랜스진3,5에대한 새로운 oHSV코딩 엔지니어링의 타당성을 더욱 높이고있다. oHSV 전파, 정화 및 티터 결정의 효율적인 시스템은 시험관 내 및 생체 내 연구를 위해 테스트할 수 있는 (새로 개발된) oHSV전에 매우 중요합니다. 본 논문은 oHSV 성장(베로 세포), 정제(자당-그라데이션 방법에 의한), 적정(베로 세포의 oHSV 플라크 분석)의 간단한 단계별 방법을 설명합니다(도1). 그것은 쉽게 전임상 연구를위한 고품질의 바이러스 성 주식을 달성하기 위해 모든 생물 안전 수준 2 (BSL2) 실험실 설정에서 채택 될 수있다.
베로, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주, oHSV전파에가장 일반적으로 사용되는 세포주9,10,11,12,13 베로 세포는 결함이 있는 항 바이러스 인터페론 신호경로(14)이다. 인터페론 유전자(STING) 신호의 불활성화 된 자극기와 다른 세포주또한 oHSV 성장(12,13)에사용될 수있다. 이 프로토콜은 oHSV 성장 및 플라크 분석에 대한 베로 세포를 활용합니다. 전파후, oHSV-감염된 세포는 수확, 용해 및 정화를 실시하며, 이에 따라 용액 세포는 먼저 벤조나제 뉴클레아아제로 처리되어 숙주 세포 DNA를 저하시키고, 핵산 단백질 응집을 방지하며, 세포 용액의 점도를 감소시한다. 벤조나아제의 적절한 활성화는 종종 Mg2 +필요하므로, 1-2 mM MgCl2이 프로토콜에 사용된다15. 벤조나제 처리된 세포 용액의 숙주 세포 파편은 고속 자당 그라데이션 원심분리 전에 직렬 여과에 의해 더 제거된다. 점성 25% 자당 용액 쿠션은 자당층을 통한 바이러스 이동 속도가 느려지도록 하여 주전자 세포 관련 성분을 상복부에 남겨두어 펠릿16에서바이러스 손실을 정화및 제한하는 데 도움이 된다. 정제 된 oHSV는 다음 베로 세포에 titrated, 바이러스 플라크는 Giemsa 염색에 의해 시각화17 또는 X-갈 염색 (락즈 인코딩 oHSV에 대한)18.
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Protocol
1) oHSV 성장
참고: oHSV와 함께 일하기 전에 기관 생물 안전 위원회의 승인을 보장하십시오. 이 연구는 승인 된 IBC 프로토콜 번호 18007에서 수행되었다. BSL2 예방 조치를 유지하십시오: 바이러스와 접촉하는 모든 파이프, 팁, 튜브 및 기타 물질을 표백합니다. 손 전에 70 % 이소 프로필 알코올스프레이 장갑은 BSL2 세포 배양 후드를 떠난다. 바이러스로 작업 한 후 항상 철저하게 비누 물로 손을 씻으십시오.
- 일 -1, 종자 낮은 통로 베로 세포 20 T-150 cm2 플라스크의 밀도에서 7-8 × 106 세포/플라스크의 밀도가 일반 베로 세포 배지에서.
참고: 베로 배지는 덜벡코의 변형된 독수리 매체(DMEM)를 10%의 열불성 태아 종아리 혈청(IFCS)으로 보충하여 제조합니다. - 0일째(세포는 80-90% 컨실수)에 베로 세포에 oHSV 접종을 추가합니다.
- 바이러스 접종 준비
- 바이러스 증폭을 위해 0.01의 복합감염(MOI)을 사용합니다(MOI는 바이러스의 복제 능력에 따라 0.01에서 0.1까지 다양할 수 있음). 20 플라스크에 대한 바이러스 (mL)의 양을 계산하기 위해 수식(1)을사용합니다.
바이러스의 양 (mL) 20 플라스크 = 바이러스의 양 필요 (pfu)/titer 의바이러스 주식 (pfu/mL)(1) - 바이러스 접종을 준비하기 위해 1% IFCS로 보충된 고혈당 덜벡코의 인산염 완충식식염수(DPBS)를 사용하여 바이러스 접종을 준비합니다(T-150cm2 플라스크 당 7mL, 즉, ~140 mL 20 플라스크용). 140mL의 고혈당 DPBS/1% IFCS 용액에 필요한 양의 oHSV를 추가하고, 1분 동안 소용돌이를 만들고, 베로 세포에 첨가할 수 있도록 혼합물을 준비한다.
- 바이러스 증폭을 위해 0.01의 복합감염(MOI)을 사용합니다(MOI는 바이러스의 복제 능력에 따라 0.01에서 0.1까지 다양할 수 있음). 20 플라스크에 대한 바이러스 (mL)의 양을 계산하기 위해 수식(1)을사용합니다.
- T-150cm2 플라스크를 2배 더 높은 포도당 DPBS로 세척하여 1% IFCS(10mL/워시)로 보충합니다. DPBS/1% IFCS를 흡인하고 7mL의 바이러스 접종률/T-150cm2 플라스크를 추가합니다.
- Vero 모노레이어 위에 접종을 적절히 분배하기 위해 플라스크 로커를 사용하여 플라스크를 5분간 부드럽게 흔들어 1.5-2h의 플라스크를 37°C에서 배양합니다. 인큐베이터 선반이 레벨인지 확인합니다.
- 접종을 제거하고 1 % IFCS (25 mL / 플라스크)로 보충 DMEM을 추가합니다. 플라스크를 2-4일 동안 배양합니다.
- 바이러스 접종 준비
- 매일 플라스크를 90-100% CPE에 확인합니다(그림 2참조).
- oHSV 감염 베로 세포를 수확.
- 50mL 원심분리기 튜브 또는 미디어 용기에서 각 플라스크(각 플라스크에 ~5mL를 남겨주세요)에서 문화 상체(~20mL)를 수집합니다.
- 셀 스크레이퍼를 사용하여 플라스크 바닥에서 셀을 부드럽게 긁어냅니다.
참고: 세포는 플라스크에서 빠르게 벗겨져야 합니다. - 각 플라스크에 ~20mL의 부피를 가져오는 각 플라스크에 ~15mL의 문화 상체(1.4.1단계수집)를 추가하고 10mL 멸균 세로지컬 파이프를 사용하여 플라스크바닥을 몇 번 부드럽게 세척한다.
참고 : 적극적으로 파이프하지 마십시오. 모든 세포를 그대로 유지하는 것을 목표로합니다. - 얼음에 50 mL 원심 분리 튜브로 세포 (+ 매체)를 수집 (20 플라스크에서 수확 된 세포의 400 mL을 보유하는 8 튜브를 사용).
- 세포를 300g에서 4°C에서 10분 동안 회전시키고 수퍼나티를 흡인시합니다.
- 1.25mL 추가 (50%) 바이러스 버퍼(VB) 및 1.25mL(50%) 각 원심분리기 튜브에 문화 상류체(1.4.1단계에서 수집)를 각 원심분리관에 철저히 다시 중단한다. 8개의 50mL 원심분리기 튜브에서 50mL 원심분리기 튜브로 재중단된 세포를 50mL 원심분리기 튜브로 이송한다.
참고: 표 1에서VB 솔루션의 준비를 참조하십시오. 미디어 멸균 필터를 사용하여 VB 용액을 필터링합니다. T-150cm 당 0.5mL의 VB + 0.5 mL의 상퍼를 사용하여 재서스펜션을 위해, 즉 20 플라스크 (20 mL)의 경우 VB 10 mL및 문화 상판 10 mL을 사용하십시오. - 드라이 아이스/100% 에탄올을 사용하여 다시 중단된 세포를 스냅 동결하고 -80°C에 보관하십시오.
2) oHSV 정화
- 스냅 동결(드라이 아이스 및 100% 에탄올)/해동(37°C 온수 욕조)은 셀이 총 3사이클동안 1분 동안 수조 초음파 처리하여 상차에서 바이러스를 방출하는 세포의 적절한 용해를 보장한다.
참고: 40kHz, 120V 파워를 사용하여 1분 동안 초음파 처리를 수행합니다. 튜닝 가능한 초음파 처리기는 사용할 수없는 경우 초음파 수조 초음파 식소식을 사용하십시오. 섹션 3에서 적정을 위해 50 μL 알리코트(aliquot)를 복용하면 정제 절차 중에 잠재적인 바이러스 손실을 담당하는 다음 단계 중 어느 단계를 식별하는 데 도움이 됩니다. - 벤조나아제 뉴클레아제(175단위/mL) + 2mM MgCl2(1M 스톡 = 2 μL/mL), 소용돌이, 37°C에서 30분 동안 배양하여 세포 용해를 치료한다. 튜브를 얼음 위에 놓고 다음 단계를 4 °C에서 수행합니다.
- 저속 원심분리에 의해 세포 잔해를 펠렛.
- 셀 용해를 300g에서 10분 동안 회전시합니다.
- 새로운 50mL 원심분리기 튜브에서 상체를 수집(VB의 0.5mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고, 펠릿-1로 지정하고, 단계 2.3.5에서 사용하기 위해 4°C에 저장; 도 1참조).
- 10 분 동안 500g에서 다시 상체 (2.3.2 단계에서 얻은)를 회전하십시오.
- 새로운 50mL 원심분리기 튜브에서 상체를 수집(VB의 0.5mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고, 펠릿-2로 지정하고, 단계 2.3.5에서 사용하기 위해 4°C에 저장; 도 1참조).
- 재중단된 펠릿-1(2.3.2에서) 및 펠릿-2(2.3.4에서)를 새로운 1.7mL 원심분리기 튜브, 소용돌이/소닉세이트(수조) 2x에 넣고 10분 동안 400g에서 회전한다. 상체를 수집하고 단계 2.3.4에서 얻은 상체와 결합; 그림 1을참조하십시오.).
참고: 40kHz, 120V 파워를 사용하여 1분 동안 초음파 처리를 수행하여 2.4 단계에서 여과 절차 전에 바이러스 응집을 방지합니다. 섹션 3에서 적정을 위해 결합 된 상체의 50 μL 알리쿼트(aliquot)를 가져 가라.
- 다음 3단계 여과 방법을 사용하여 결합된 수퍼네티트(~21mL, 즉, 1.4.6에서 20mL, 2.3.2에서 0.5mL, 0.5mL)를 필터링한다.
- 10mL 주사기(필터를 쉽게 통과할 수 있는 매번 5-7mL)를 사용하여 21mL의 미퍼를 끌어내고 새로운 50mL 원심분리관(TUBE 1로표시)에 배치된 멸균 5 μm 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인 필터를 통과한다.
- 2.4.1(바이러스 수퍼나티의 남은 미량 수집), 소용돌이에 비워진 50mL 원심분리기 튜브에 VB 1mL을 추가하고 튜브 1에 배치된 동일한 5μm PVDF 필터를 통과합니다(총 22mL의 여과율). 2.4.2 단계로 진행합니다.
- 튜브 1(2.4.1에서와 같이)에서 22mL의 여과를 끌어서 새로운 50mL 원심분리기 튜브에 배치된 멸균 0.8 μm 혼합 셀룰로오스 에스테르(MCE) 멤브레인 필터를 통과한다(TUBE 2로 표시).
- 2.4.2단계, 소용돌이에 비워진 튜브 1에 VB 1mL을 추가하고 튜브 2에 배치된 동일한 0.8 μm MCE 필터를 통과합니다(총 23mL의 여과율). 2.4.3 단계로 진행합니다.
- 튜브 2(2.4.1에서 와 같이)에서 23mL의 여과를 끌어새로운 50mL 원심분리기 튜브(TUBE 3로표시)에 배치된 멸균 0.45 μm PVDF 필터를 통과한다.
- 2.4.3 단계에서 비워진 TUBE 2에 VB 1mL을 추가하고 튜브 3에 배치된 동일한 0.45 μm PVDF 필터를 통과합니다(총 24mL의 여과율).
참고: 섹션 3에서 적정을 위해 여과의 50 μL 알리쿼트복용하십시오.
- 2.4.3 단계에서 비워진 TUBE 2에 VB 1mL을 추가하고 튜브 3에 배치된 동일한 0.45 μm PVDF 필터를 통과합니다(총 24mL의 여과율).
- 10mL 주사기(필터를 쉽게 통과할 수 있는 매번 5-7mL)를 사용하여 21mL의 미퍼를 끌어내고 새로운 50mL 원심분리관(TUBE 1로표시)에 배치된 멸균 5 μm 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인 필터를 통과한다.
- 자당 그라데이션 방법을 이용한 고속 원심분리
참고: 고정 각도 F13-14x50cy 로터가 이 프로토콜에 사용되었습니다. 로터와 원심분리기는 다음 단계를 진행하기 전에 4°C에 있어야 합니다.- 새로운 50mL 원추형 원심분리기 튜브에 얼음냉이 멸균 여과 25% 자당 용액(행크의 균형 잡힌 소금 용액 100mL에 25g의 자당 분말을 용해하여 제조)을 추가합니다.
- 천천히(3mL/분)은 자당층 위에 바이러스 여과(2.4.3.1 단계에서 얻은) 24mL를 첨가한다. 바이러스 여과 및 자당 용액의 별도의 층을 유지관리하십시오.
참고: 바이러스 층의 최대 30mL는 자당 용액의 10mL 이상을 첨가할 수 있다. - 4°C에서 22,620g에서 90분 동안 튜브원심분리기를 합니다.
- 50mL 원심분리기 튜브에서 상피및 자당층을 제거합니다.
참고 : 바이러스 펠릿은 희끄럽어야합니다. 3절에 적정을 위해 상체의 50 μL 알리쿼트와 자당층의 50 μL 알리쿼트를 섭취하십시오.
- 10% 글리세롤/PBS 용액에서 펠릿을 다시 중단합니다.
- 50mL 원심분리기 튜브에 멸균 1m의 글리세롤(PBS희석)을 첨가하여 펠릿을 덮습니다.
참고: 재부유 혼합물의 양은 펠릿 크기에 따라 달라질 수 있다(예: 0.8-1.2 mL). 더 작은 부피는 바이러스의 더 높은 농도를 줄 것이다. - 50mL 원심분리기 튜브를 얼음위에 2-4시간 동안 놓습니다. 이 기간 동안 펠릿을 15분마다 소닉/소용돌이시켜 펠릿을 빼내/다시 중단합니다.
- 2 mL 마이크로 센트심분리기 튜브에서 재중단 펠릿(1mL 의 10% 글리세롤/PBS + 펠릿 크기)을 수집하여 총 부피를 ~1.3mL로 가져옵니다. [선택 사항: 동일한 50mL 원심 분리기 튜브에 10% 글리세롤/PBS의 0.3mL을 추가하여 펠릿의 남은 미량, 파이펫 위 및 하강, 2.6.3단계에서 다시 매달린 펠릿과 결합하여 총 부피를 ~1.6mL로 가져옵니다.]
- 2.6.3 단계에서 의현액이 혼탁 또는 흐린 경우(세포 파편에 의한), 원심분리관은 10분 동안 500g에서 튜브를 원심분리하고, 상체관을 새로운 2mL 미세원심분리기 튜브로 이송하고, 2.6.4단계로 진행한다.
- 섹션 3에서 oHSV 적정을 위해 50 μL 알리코트를 가져 가라. Aliquot는 나머지 용액(250 μL/aliquot)을 나사 캡이 있는 멸균 미세 원심분리기 튜브(장기 보관을 위해 잘 밀봉됨), 스냅 동결 및 -80°C에서 사용할 때까지 저장(oHSV 티터가 결정되면 실험 연구를 위한 준비)에 넣습니다.
참고: 바이러스와 접촉하는 모든 물질은 후드 또는 폐기에서 제거하기 전에 표백되거나 자외선으로 처리되어야 합니다.
- 50mL 원심분리기 튜브에 멸균 1m의 글리세롤(PBS희석)을 첨가하여 펠릿을 덮습니다.
3. oHSV 적정 및 플라크 분석
- 종자 1.7-1.8 x 105 베로 세포/베로 세포/베로 세포/웰 에 베로 세포 배지에서 6웰 세포 배양 플레이트(10% IFCS를 가진 DMEM; 단계 1.1 참조).
참고: 세포가 우물 전체에 균질적으로 분포되어 있는지 확인하십시오. 우물 의 중간에 세포의 축적을 일으킬 수있는 접시를 소용돌이하지 마십시오. 소용돌이를 방지하기 위해 손으로 접시를 수직으로 천천히 흔들어 서 수평으로 한 다음 접시를 인큐베이터에 부드럽게 놓습니다. - 다음 날 (세포가 70-80 %의 합류에 도달하면), 배양 배지를 흡인하고 1 % IFCS로 보충 된 고혈당 PBS의 1 mL / 웰을 추가합니다. 3.3 단계가 완료될 때까지 플레이트를 세포 배양 후드에 둡니다.
- PBS/1% IFCS(그림3)를사용하여 5mL 폴리프로필렌 튜브에서 바이러스를 연일 희석시 희석시.
참고: 2.6.4 단계에서 수집된 50 μL 알리코치를 사용하여 직렬 희석을 합니다. 1st 튜브 (10-3 희석)에서 1998 년 PBS / 1 % IFCS, 소용돌이의 2 μL바이러스를 추가합니다. 2nd 튜브(10-5 희석)에서1st 튜브에서 PBS/1% IFCS, 소용돌이의 990 μL에서 10 μL을 섭취하십시오. 3rd 튜브 (10-6 희석)에서 PBS / 1 % IFCS, 소용돌이의 900 μL에서 2nd 튜브에서 100 μL을 복용하십시오. 이 10배 직렬 희석을10-9 희석할 때까지 계속합니다. 그림 3의세부 정보를 참조하십시오. - PBS/1% IFCS를 흡인시키고, 베로 세포에 연속희석 바이러스(10-5 ~10-9부터)의 0.7mL/웰을 첨가한다.
참고: 세포가 건조시키지 마십시오. - 실온에서 5 분 동안 로커에 접시를 부드럽게 흔들어 (바이러스 접종의 균일 한 분포를 보장하기 위해).
- 플레이트를 37°C에서 1.5h로 배양합니다.
참고: 이 잠복기 동안, DMEM에서 인간 면역글로불린 G(IgG)의 1:1000 희석을 1%의 IFCS로 보충하였다. 6웰 플레이트의 경우 12.5mL를 준비하여 2mL/웰을 3.7단계에서 사용할 수 있습니다. 인간 IgG의 로트 변화를 고려하여 희석을 조정합니다. - 우물에서 바이러스 접종을 제거하고, 0.1% 인간 IgG의 2mL/웰을 추가하고(배양 배지에서 oHSV를 중화하고 이차 플라크의 형성을 방지하기 위해) DMEM에서 1%의 IFCS로 보충한다. 3-4 일 동안 37 °C에서 플레이트를 배양하십시오.
참고: 명확한 플라크는 일반적으로 3일 후에 형성됩니다. - 플레이트 고정 및 염색
- 상체를 제거하고 5 분 동안 순수 메탄올 (1 mL / 웰)으로 세포를 고정하십시오. 메탄올을 제거하고 접시가 공기 건조하도록 합니다.
- 기임사 얼룩 (1:5)을 탈온화 물로 희석하고 희석 된 Giemsa 얼룩의 1 mL을 잘 넣습니다. 10-15 분 동안 실온에서 접시를 배양하십시오.
- 얼룩을 제거하고 수돗물로 헹구고 접시가 공기 건조되도록 합니다.
- 해부 현미경을 사용하여 플라크를 계산합니다.
- lacZ 식이 있는 oHSV의 경우 선택 사항:
- 상체를 제거하고, 차가운 0.2 % 글루타랄데히드 / 2 % 파라 포름 알데히드로 세포를 실온에서 5-10 분 동안 고정하십시오.
- 고정 용액을 제거하고 PBS로 셀을 3배 세척합니다.
- 세포(1mL/웰)에 X-gal 용액을 추가하고 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
참고 : X-갈 얼룩은 염색당일에 신선하게 준비해야합니다. 장기 보관은 색상이 희변할 수 있습니다. 표 1에서X-gal 솔루션의 준비를 참조하십시오. - X-gal 얼룩을 제거하고 접시를 수돗물로 1 분 동안 씻으릅니다.
- 상온에서 2분 동안 중립 적색 용액(1mL/웰)을 장착한 카운터 얼룩.
참고: 표 1에서중립 적색 솔루션 의 준비를 참조하십시오. - 접시를 수돗물로 1 분 동안 씻으십시오. 접시를 공기 건조시키십시오.
- 해부 현미경을 사용하여 파란색 플라크를 계산합니다(그림4).
- 수식(2)을사용하여 티터를 계산하십시오.
pfu/mL(플라크 성형 단위)의 티터 = 플라크 수/0.7 mL × 희석계수(2)
참고: 예를 들어,10-9 희석에서 25개의 플라크가 잘 발견되는 경우, 티터는 25/0.7 ×109 = 35.7 ×109 = 3.57 × 1010 pfu/mL이다. 이것은 2.6.4 단계에서 준비된 알리쿼트의 최종 oHSV 티터입니다.
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Representative Results
전체 프로토콜에 대한 간략한 개요는 oHSV의 성장, 정화 및 적정과 관련된 중요한 단계를 나타내는 그림 1에묘사됩니다. 베로 세포에서 CPE는 HSV 감염 후 4시간 감염19로일찍 검출될 수 있다. 도 2는 oHSV 감염 다음 세 가지 다른 시점에서 베로 세포에서 CPE를 시연한다. 시간이 지남에 따라 CPE 수준이 증가합니다. 이 프로토콜에서, 90-100% CPE는 일반적으로 저MOI oHSV 접종의 48 시간 내에서 관찰됩니다 (이는 정화를 위한 세포를 수확하는 가장 좋은 시간입니다). 그러나, 1.2 단계 및/또는 oHSV의 복제 잠재력에서 접종된 oHSV MOI에 따라 최대 4일이 걸릴 수 있습니다. 이 기간 이외에도 CPE를 가진 세포는 용액을 제거하여 상체에서 바이러스가 방출될 수 있습니다. 따라서, 높은 바이러스 성 티터를 얻기 위해, 그들은 그대로 때 CPE 영향을받는 세포를 수확하는 것이 중요하다. 최종 바이러스 티터에 기여하는 또 다른 중요한 요소는 oHSV 증폭에 사용되는 조직 배양 플라스크의 수 또는 크기입니다. 도 3은 플라크 분석법에 의한 티터 판정에 필요한 주어진 바이러스 스톡(2.6.4단계에서 획득)의 직렬 희석(10-3 ~ 10-9)의 과정을 묘사한다. lacZ 발현이 있는 oHSV의 경우, 바이러스 플라크는 X-gal염색(도 4)에의해 시각화될 수 있다. 본 프로토콜에서는 20T-150cm2 조직 배양 플라스크가 사용되었으며, 1× 10 10 pfu/mL의 티터가 있는 oHSV 스톡의 1.3-1.6mL이 예상될 수 있다.
그림 1: oHSV 성장, 정화 및 플라크 분석과 관련된 주요 단계의 회로도 프리젠 테이션. 약어: oHSV = 온코틱 포진 심플렉스 바이러스; CPE = 세포병증 효과; VB = 바이러스 버퍼; HBSS = 행크의 균형 잡힌 소금 솔루션; PBS = 인산염 완충식식염. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: oHSV 감염 후 베로 세포에서 세포 요법 효과. 베로 세포는 mCherry용 oHSV 코딩(적색 형광으로 도시됨)을 0.01의 MOI에서 접종하고 36, 48 및 72h 바이러스 감염시 이미지(10배율)를 접종하였다. CPE는 oHSV 감염 된 세포의 반올림에 의해 확인됩니다 (검은 화살표로 표시). 스케일 바 = 200 μm. 약어 : oHSV = 온코틱 포진 심플렉스 바이러스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 플라크 에세이용 oHSV 재고의 직렬 희석. 프로토콜의 3.3 단계도 참조하십시오. 약어 : oHSV = 온코틱 포진 심플렉스 바이러스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 72h 이후 oHSV 감염에서 X-gal-염색 플라크의 대표적인 이미지. 희석되지 않은(상부 웰) 및 희석(1:10; 하부 웰) oHSV 감염 세포 배양 슈퍼나탕제(70-80% 컨런트),X-gal 염색 프로토콜이 3.8.5항(중립 적색으로 반염색 제외)에 그 뒤를 이었다. X-gal-염색 바이러스 플라크(왼쪽 패널에서)의 대표적인 이미지는 중간(4배, 스케일 바 = 1000 μm) 및 오른쪽(10x; 스케일 바 = 200 μm) 패널에 제시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 솔루션 컴포지션 | |
| 바이러스 버퍼 의 준비 | 양 |
| 염화 나트륨 1M | 15 mL |
| 1 M 트리스 염산염 | 3 mL |
| 정제수 | 132 mL |
| pH를 6.8로 조정 | |
| X-gal 용액 준비(6웰 플레이트 1개용~6.5mL) | |
| 250 mM 칼륨 페리시야니데 | 130 μL |
| 250 mM 칼륨 페로시니데 | 130 μL |
| 염화 마그네슘 1M | 13 μL |
| 디메틸 설플옥화물(DMSO)에서 X-gal 사전 용해(20 mg/mL) | 162.5 μL |
| PBS | 6064.5 μL |
| 하나의 6 웰 플레이트에 대한 중립 적색 용액의 준비 | |
| 중립 적색 솔루션 | 100 μL |
| 메탄올 | 1 mL |
| 정제수 | 7 mL |
표 1: 솔루션 구성.
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Discussion
프로토콜은 낮은 통로 베로 세포에서 oHSV의 성장으로 시작합니다. 베로 세포 단층의 합류는 자란 세포가 베로세포(20)로oHSV 입력을 감소시킬 수 있는 단단한 섬유구조를 개발할 수 있기 때문에 바이러스 접종 시에 ~80%여야 한다. 일단 90-100% CPE가 관찰되면, 배양 상체가 제거되고, 세포가 수확되고, VB/수퍼나탄트에서 재장매되고(단계 1.4.6 참조), 스냅 냉동, 및 나중에 정화를 위해 -80°C에 저장된다. Blaho와 동료는 감염된 베로 세포의 수확 및 저장의 약간 다른 방법을 고용했습니다. 예를 들어, 세포 및 배양 매체를 포함하는 플라스크(1% 소 세럼 알부민 및 PBS칼륨으로 보충됨)는 처음에는 -80°C에서 최소 15분 동안 저장되며, 이어서 실온에서 플라스크의 느린 워밍업이 뒤따릅니다. 세포는 그 때 살균 우유와 혼합하고, 정수20까지-80 °C에 저장됩니다. 이 경우 멸균 우유는 안정제 역할을 하며, 바이러스 육수의 티터가 단독으로20개에비해 멸균 우유/배지에 저장될 때 극적으로 높다는 것이 입증되었다. 그러나, 또 다른 연구에서는-80°C에서 여러 헤르페스바이러스의 저장에 사용되는 상이한 안정제(멸균 우유 포함)를 직접 비교하는 것은 최종 바이러스티터(21)에어떤 중요한 영향을 미치지 않았다. 여기서, 세포 펠릿은 실험 연구를 위해 일반적으로 높은 바이러스 티터를 제공하는 저장 안정제로서 트리스 버퍼 식염수(pH 6.8) 및 10% 글리세롤로 구성된 VB에서 재중단되었다.
고품질 바이러스 스톡을 얻기 위해 재중단 된 펠릿에서 모든 세포 및 미디어 관련 구성 요소를 제거하는 것이 중요합니다. 비 바이러스 성 입자의 제거는 생체 내 실험 중에 잠재적인 면역 반응을 피하기 위해 중요합니다. 바이러스 정화의 몇몇 방법은원심분리(22),상이한 그라데이션방법(23,여과(24) 및 친화크롬토그래피(25)를 포함하는 것으로 기술되었다. 이 프로토콜은 자당 그라데이션 방법을 사용하여 고속 원심분리를 기반으로 하지만, iodixanol11,26,Percoll27및 Ficoll-Nycodenz23과같은 다른 사용자가 다양한 그라데이션 방법을 사용하였다. 이러한 그라데이션 방법은 밀도에 의해 바이러스를 분리하고 바이러스가 펠릿되는 자당 쿠션 대신 그라데이션에서 밴드의 격리를 필요로한다. 자당 그라데이션 방법은 바이러스 성 감염성을 유지하면서 바이러스 봉투 단백질을 방해할 위험을 최소화하기 때문에 바이러스 성 입자를 분리하는 부드러운 접근 방식을 제공합니다. 이러한 장점에도 불구 하 고, 농축 된 자당 용액의 높은 발진 바이러스 입자를 탈수 수 있습니다.; 따라서, 이오디산올 그라데이션 방법은 이러한 단점을 극복하기 위해 개발되었다. 그러나, iodixanol 그라데이션 방법은 극심분리기 및 비리온 대역의 수집이 필요하다. oHSV 정화 중에 고려해야 할 다른 요인은 원심분리의 속도와 시간 및 장기 저장에 사용되는 바이러스 버퍼의 선택입니다. 이 프로토콜은 oHSV의 순도가 확인되지 않는 한계를 가지고; 그러나, 기능성 바이러스 입자의 높은 숫자는 베로 세포에 적정에 의해 주어진 정제 된 oHSV 주식에서 발견되었다 (섹션 3 참조).
oHSV는 베로 세포에 플라크를 형성한다(그림4). 바이러스 성 플라크는 Giemsa 염색에 의해 식별 될 수 있습니다, 이는 쉽고 편리한 방법입니다. Giemsa는 Vero 세포를 얼룩지게하며, 쉽게 시각화 할 수있는 바이러스 플라크가 투명하거나 비어 있으며 해부 현미경을 사용하여 계산됩니다. 아가로즈 또는 메틸셀룰로오스로 미디어를 오버레이하는 동안 일반적으로 플라크 형성(3.7단계에서)이 바이러스 및 이차 감염 및 플라크 꼬리의확산을방지하는 데 사용되며, 인간 IgG를 사용하여 문화 상복부에서 oHSV를 중화시키는 것이 더 쉽고 편리하다. hs를발현하는 oHSV의 경우, 형광 현미경 검사법은 형광 단백질(즉, 녹색 형광 단백질)을 표현하는 oHSV18에사용되는 반면, 형광 현미경 검사는 X-gal 염색(도4)에의해 시각화될 수 있다. oHSV-감염된 세포를 검출하기 위한 추가 분석약으로는 oHSV 특이적항체(29)를 이용한 면역-히스토케미칼 또는 형광또는-형광또는 근적외선 형광-공주 형 oHSV 특이적 항체30의레이저 기반 스캐닝을 포함한다.
미생물(박테리아, 효모 또는 곰팡이) 오염 및 건강한 베로 세포를 방지하기 위해 멸균을 유지하는 등 좋은 바이러스 육수를 달성하기 위해 따라야 할 중요한 조치가 있습니다. oHSV의 봉투는 매우열민감20이기때문에, oHSV 재고는 10% 글리세롤과 같은 냉동 보호제로 처리되어야 한다. 전반적으로, 이 프로토콜은 실험실 환경에서 쉽게 채택되고 연습될 수 있지만 대규모 바이러스 생산에는 유용하지 않을 수 있습니다.
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Disclosures
SDR은 암젠과 액티벡(ActiVec Inc.)로부터 로열티를 받았으며 EG 427의 과학 자문위원회에 소속되어 있는 조지타운 대학과 매사추세츠 종합 병원에서 소유하고 관리하는 온연성 포진 심플렉스 바이러스와 관련된 특허에 대한 공동 발명가입니다. 다른 저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
사하 연구소의 연구는 법무부 (W81XWH-20-1-0702)와 닷지 존스 재단 - 애빌렌의 자금에 의해 부분적으로 지원되었다. 새뮤얼 D. 랍킨과 멜리사 R.M 험프리는 NIH(R01 CA160762)의 지원을 부분적으로 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
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