Voorbereiding van hoge temperatuur monsterroosters voor Cryo-EM
Summary
Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van monsterrasters bij temperaturen tot 70 °C, voorafgaand aan het invriezen van de duik voor cryo-EM-experimenten.
Abstract
De monsterrasters voor cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) experimenten worden meestal voorbereid bij een temperatuur die optimaal is voor de opslag van biologische monsters, meestal bij 4 °C en soms bij kamertemperatuur. Onlangs ontdekten we dat de eiwitstructuur die bij lage temperatuur wordt opgelost, mogelijk niet functioneel relevant is, met name voor eiwitten uit thermofiele archaea. Er werd een procedure ontwikkeld om eiwitmonsters bij hogere temperaturen (tot 70 °C) voor cryo-EM-analyse voor te bereiden. We toonden aan dat de structuren van monsters die bij hogere temperaturen worden bereid, functioneel relevant en temperatuurafhankelijk zijn. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van monsterroosters bij hoge temperatuur, met 55 °C als voorbeeld. Het experiment maakte gebruik van een verglazingsapparaat dat was aangepast met behulp van een extra centrifugebuis en monsters werden geïncubeerd bij 55 °C. De gedetailleerde procedures werden verfijnd om dampcondensatie te minimaliseren en een dunne laag ijs op het rooster te verkrijgen. Voorbeelden van succesvolle en mislukte experimenten worden gegeven.
Introduction
De cryo-EM-technologie voor het oplossen van de structuren van eiwitcomplexen is blijven verbeteren, met name in de richting van het verkrijgen van structuren met hoge resolutie 1,2. In de tussentijd is het landschap van de toepassing ervan ook uitgebreid door de monsteromstandigheden te variëren, zoals pH of liganden voorafgaand aan het vitrificatieproces3, waarbij monsterroosters worden voorbereid, gevolgd door dompelbevriezing 4,5. Een andere belangrijke voorwaarde is de temperatuur. Hoewel cryo-EM-experimenten, zoals röntgenkristallografie, worden uitgevoerd bij lage temperaturen, weerspiegelt de structuur die door cryo-EM wordt opgelost de structuur in de oplossingstoestand voorafgaand aan vitrificatie. Tot voor kort gebruikten de meeste cryo-EM-onderzoeken met enkelvoudige deeltjesanalyse (SPA) monsters die op ijs worden bewaard (d.w.z. bij 4 °C) voorafgaand aan vitrificatie6, hoewel een aantal studies monsters gebruiken bij ongeveer kamertemperatuur 7,8,9,10 of zo hoog als 42 °C11. In een recent rapport voerden we temperatuurafhankelijke studies uit van het enzym ketolzuurreductoisomerase (KARI) van het thermofiele archaeon Sulfolobus solfataricus (Sso) bij zes verschillende temperaturen van 4 °C tot 70 °C12. Onze studies suggereren dat het belangrijk is om monsterrasters voor te bereiden op functioneel relevante temperaturen en dat cryo-EM de enige structurele methode is die praktisch haalbaar is voor het oplossen van de structuur van hetzelfde eiwitcomplex bij meerdere temperaturen.
De grootste moeilijkheid voor vitrificatie bij hoge temperaturen is het minimaliseren van dampcondensatie en het bereiken van dun ijs. Hier rapporteren we het gedetailleerde protocol dat wordt gebruikt voor het voorbereiden van monsterroosters bij hoge temperaturen in onze eerdere studie van de Sso-KARI 12. We gaan ervan uit dat de lezers of kijkers al ervaring hebben met de algemene monstervoorbereiding en gegevensverwerkingsprocedures voor cryo-EM-experimenten en benadrukken de aspecten die relevant zijn voor hoge temperaturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zorg er in stap 1 van het protocol voor dat de centrifugebuis goed is geïnstalleerd en niet valt wanneer het experiment aan de gang is. Vanwege de accumulatie van een groot aantal waterdruppels in de kamer, die de adsorptiecapaciteit van het filterpapier kunnen veranderen, wordt aanbevolen dat de totale tijd van het experiment niet langer mag zijn dan 30 minuten nadat de vitrificatieapparaatkamer de evenwichtstemperatuur heeft bereikt. Als de bedrijfstijd langer is dan 30 minuten, moet de operator het filterpapier verva…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Dr. Hervé Remigy van Thermo Fisher Scientific voor nuttig advies. De cryo-EM experimenten werden uitgevoerd in de Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM wordt ondersteund door Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) en Taiwan Protein Project (subsidienr. AS-KPQ-109-TPP2). De auteurs bedanken ook mevrouw Hui-Ju Huang voor de hulp bij de monstervoorbereiding.
Materials
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
References
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do’s and don’ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
