إعداد شبكات عينات ذات درجة حرارة عالية ل Cryo-EM
Summary
توفر هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لإعداد شبكات العينات عند درجات حرارة تصل إلى 70 درجة مئوية، قبل التجمد الغاطس لتجارب التبريد الكهرومغناطيسي.
Abstract
عادة ما يتم إعداد شبكات العينات لتجارب المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) عند درجة حرارة مثالية لتخزين العينات البيولوجية ، معظمها عند 4 درجات مئوية وأحيانا في درجة حرارة الغرفة. في الآونة الأخيرة ، اكتشفنا أن بنية البروتين التي تم حلها في درجة حرارة منخفضة قد لا تكون ذات صلة وظيفية ، خاصة بالنسبة للبروتينات من العتائق المحبة للحرارة. تم تطوير إجراء لإعداد عينات البروتين في درجات حرارة أعلى (تصل إلى 70 درجة مئوية) لتحليل cryo-EM. أظهرنا أن الهياكل من العينات المعدة في درجات حرارة أعلى ذات صلة وظيفية وتعتمد على درجة الحرارة. هنا نصف بروتوكولا مفصلا لإعداد شبكات العينات عند درجة حرارة عالية ، باستخدام 55 درجة مئوية كمثال. استخدمت التجربة جهاز تزجيج تم تعديله باستخدام أنبوب طرد مركزي إضافي ، وتم تحضين العينات عند 55 درجة مئوية. تم ضبط الإجراءات التفصيلية بدقة لتقليل تكثيف البخار والحصول على طبقة رقيقة من الجليد على الشبكة. يتم تقديم أمثلة على التجارب الناجحة وغير الناجحة.
Introduction
استمرت تقنية cryo-EM لحل هياكل مجمعات البروتين في التحسن ، خاصة في اتجاه الحصول على هياكل عالية الدقة 1,2. في غضون ذلك ، تم توسيع نطاق تطبيقه أيضا عن طريق تغيير ظروف العينة مثل الرقم الهيدروجيني أو الليكاندات قبل عملية التزجيج3 ، والتي تنطوي على إعداد شبكات العينات تليها تجميد الغطس 4,5. شرط آخر مهم هو درجة الحرارة. على الرغم من أن تجارب cryo-EM ، مثل علم البلورات بالأشعة السينية ، يتم إجراؤها في درجات حرارة منخفضة ، إلا أن البنية التي تم حلها بواسطة cryo-EM تعكس البنية في حالة الحل قبل التزجيج. حتى وقت قريب، تستخدم غالبية دراسات تحليل الجسيمات المفردة (SPA) cryo-EM عينات يتم الاحتفاظ بها على الجليد (أي عند 4 درجات مئوية) قبل التزجيج6، على الرغم من أن عددا من الدراسات تستخدم عينات عند درجة حرارة الغرفة حوالي7،8،9،10 أو تصل إلى 42 درجة مئوية 11. في تقرير حديث ، أجرينا دراسات تعتمد على درجة الحرارة لإنزيم اختزال حمض الكيتول (KARI) من الأركايون المحب للحرارة Sulfolobus solfataricus (Sso) في ست درجات حرارة مختلفة من 4 درجات مئوية إلى 70 درجة مئوية12. تشير دراساتنا إلى أنه من المهم إعداد شبكات العينات في درجات حرارة ذات صلة وظيفيا وأن cryo-EM هي الطريقة الهيكلية الوحيدة الممكنة عمليا لحل بنية نفس مركب البروتين في درجات حرارة متعددة.
تتمثل الصعوبة الرئيسية للتزجيج في درجات الحرارة العالية في تقليل تكثيف البخار وتحقيق جليد رقيق. هنا نبلغ عن البروتوكول التفصيلي المستخدم لإعداد شبكات العينات في درجات حرارة عالية في دراستنا السابقة ل Sso-KARI 12. نفترض أن القراء أو المشاهدين لديهم خبرة بالفعل في إجراءات إعداد العينات ومعالجة البيانات الشاملة لتجارب cryo-EM ونؤكد على الجوانب ذات الصلة بارتفاع درجة الحرارة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الخطوة 1 من البروتوكول ، تأكد من تثبيت أنبوب جهاز الطرد المركزي بشكل جيد ولا يسقط عندما تكون التجربة قيد التقدم. نظرا لتراكم عدد كبير من قطرات الماء في الغرفة ، مما قد يغير قدرة الامتزاز لورق الترشيح ، يوصى بعدم تجاوز الوقت الإجمالي للتجربة 30 دقيقة بعد وصول غرفة جهاز التزجيج إلى درجة حرا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور هيرفي ريميجي من Thermo Fisher Scientific على المشورة المفيدة. تم إجراء تجارب cryo-EM في منشأة Academia Sinica Cryo-EM (ASCEM). يتم دعم ASCEM من قبل Academia Sinica (رقم المنحة. AS-CFII-108-110) ومشروع تايوان للبروتين (رقم المنحة. AS-KPQ-109-TPP2). كما يشكر المؤلفون السيدة هوي – جو هوانغ على المساعدة التي قدمتها في إعداد العينة.
Materials
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
References
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do’s and don’ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311 (2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -. F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
