Vorbereitung von Hochtemperatur-Probengittern für Kryo-EM
Summary
Dieses Papier enthält ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung von Probengittern bei Temperaturen von bis zu 70 °C vor dem Einfrieren von Proben für Kryo-EM-Experimente.
Abstract
Die Probengitter für Kryo-Elektronenmikroskopie-Experimente (Kryo-EM) werden üblicherweise bei einer für die Lagerung biologischer Proben optimalen Temperatur präpariert, meist bei 4 °C und gelegentlich bei Raumtemperatur. Kürzlich haben wir entdeckt, dass die Proteinstruktur, die bei niedrigen Temperaturen gelöst wird, möglicherweise nicht funktionell relevant ist, insbesondere für Proteine aus thermophilen Archaeen. Es wurde ein Verfahren entwickelt, um Proteinproben bei höheren Temperaturen (bis zu 70 °C) für die Kryo-EM-Analyse vorzubereiten. Wir haben gezeigt, dass die Strukturen von Proben, die bei höheren Temperaturen präpariert wurden, funktionell relevant und temperaturabhängig sind. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung von Probengittern bei hohen Temperaturen am Beispiel von 55 °C. Das Experiment verwendete eine Vitrifikationsapparatur, die mit einem zusätzlichen Zentrifugenröhrchen modifiziert wurde, und die Proben wurden bei 55 °C inkubiert. Die detaillierten Verfahren wurden fein abgestimmt, um Dampfkondensation zu minimieren und eine dünne Eisschicht auf dem Gitter zu erhalten. Beispiele für erfolgreiche und erfolglose Experimente werden gegeben.
Introduction
Die Kryo-EM-Technologie zur Lösung der Strukturen von Proteinkomplexen hat sich weiter verbessert, insbesondere in Richtung der Gewinnung hochauflösender Strukturen 1,2. In der Zwischenzeit wurde die Anwendungslandschaft auch durch Variation der Probenbedingungen wie pH-Wert oder Liganden vor dem Vitrifikationsprozess3 erweitert, der die Vorbereitung von Probengittern mit anschließendem Tauchgefrieren beinhaltet 4,5. Eine weitere wichtige Bedingung ist die Temperatur. Obwohl Kryo-EM-Experimente, wie die Röntgenkristallographie, bei niedrigen Temperaturen durchgeführt werden, spiegelt die durch Kryo-EM gelöste Struktur die Struktur im Lösungszustand vor der Vitrifikation wider. Bis vor kurzem verwendete die Mehrheit der Einzelpartikelanalyse (SPA) Kryo-EM-Studien Proben, die vor der Vitrifikation auf Eis gehalten wurden(dh bei 4 ° C), obwohl eine Reihe von Studien Proben bei etwaRaumtemperatur 7,8,9,10 oder so hoch wie 42 ° C 11 verwendet. In einem aktuellen Bericht haben wir temperaturabhängige Untersuchungen des Enzyms Ketolsäure-Reduktoisomerase (KARI) aus dem thermophilen Archaeon Sulfolobus solfataricus (Sso) bei sechs verschiedenen Temperaturen von 4 °C bis 70 °C durchgeführt12. Unsere Studien legen nahe, dass es wichtig ist, Probengitter bei funktionell relevanten Temperaturen vorzubereiten und dass Kryo-EM die einzige Strukturmethode ist, die praktisch möglich ist, um die Struktur desselben Proteinkomplexes bei mehreren Temperaturen zu lösen.
Die Hauptschwierigkeit bei der Verglasung bei hohen Temperaturen besteht darin, die Dampfkondensation zu minimieren und dünnes Eis zu erreichen. Hier berichten wir über das detaillierte Protokoll, das für die Vorbereitung von Probengittern bei hohen Temperaturen in unserer früheren Studie des Sso-KARI 12 verwendet wurde. Wir gehen davon aus, dass die Leser oder Betrachter bereits Erfahrung mit den gesamten Probenvorbereitungs- und Datenverarbeitungsverfahren für Kryo-EM-Experimente haben und betonen die für hohe Temperaturen relevanten Aspekte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stellen Sie in Schritt 1 des Protokolls sicher, dass das Zentrifugenröhrchen gut installiert wurde und nicht herunterfällt, wenn das Experiment läuft. Aufgrund der Ansammlung einer großen Anzahl von Wassertröpfchen in der Kammer, die die Adsorptionskapazität des Filterpapiers verändern könnten, wird empfohlen, dass die Gesamtzeit des Experiments 30 min nicht überschreiten sollte, nachdem die Vitrifikationsapparatekammer die Gleichgewichtstemperatur erreicht hat. Wenn die Betriebszeit 30 Minuten überschreitet, m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Hervé Remigy von Thermo Fisher Scientific für nützliche Ratschläge. Die Kryo-EM-Experimente wurden an der Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM) durchgeführt. ASCEM wird unterstützt von der Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) und Taiwan Protein Project (Grant No. AS-KPQ-109-TPP2). Die Autoren danken auch Frau Hui-Ju Huang für die Unterstützung bei der Probenvorbereitung.
Materials
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
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