Summary
Her præsenterer vi en metode til isolering af Extracellular Vesicles (EVs) afledt af blodpladelyset (PL) og deres anvendelse til belægning titanium (Ti) implantatoverflader. Vi beskriver drop casting belægning metode, elbiler frigivelse profil fra overfladerne, og in vitro biokompatibilitet af elbiler belagt Ti overflader.
Abstract
Ekstracellulære vesikler (elbiler) er biologiske nanovesicles, der spiller en central rolle i cellekommunikation. Deres indhold omfatter aktive biomolekyler såsom proteiner og nukleinsyrer, som udgør et stort potentiale i regenerativ medicin. For nylig har elbiler afledt af Blodplade lysat (PL) vist en osteogen kapacitet, der kan sammenlignes med PL. Desuden anvendes biomaterialer ofte i ortopædi eller tandgenopretning. Her tilbyder vi en metode til at functionalisere Ti overflader med PL-afledte elbiler for at forbedre deres osteogene egenskaber.
Elbiler er isoleret fra PL efter størrelse eksklusionskromatografi, og bagefter er Ti overflader funktionaliseret med PL-elbiler ved drop casting. Funktionalisering er bevist ved elbiler frigivelse og dens biokompatibilitet ved laktat dehydrogenase (LDH) frigivelse assay.
Introduction
Elbiler er membran vesikler (30-200 nm) udskilles af enhver celle og spiller en central rolle i celle-til-celle kommunikation ved at levere deres last. De indeholder en række aktive biomolekyler, der kan omfatte nukleinsyrer, vækstfaktorer, eller bioaktive lipider1. Af disse grunde er elbiler blevet evalueret for deres potentielle anvendelse i terapi. Med hensyn til ortopædi og knogle regenerering, elbiler fra forskellige kilder er blevet testet. Blandt dem har blodplade-afledte elbiler vist sig at fremkalde en differentiering effekt på stamceller og samtidig opretholde en lav cytotoksisk profil2,3. Derfor er der behov for yderligere forskning for at undersøge muligheden for at kombinere elbiler med biomaterialer for at bruge dem i daglig klinisk praksis.
Titanium-baserede biomaterialer er meget udbredt som stilladser for knoglehelbredelse kliniske interventioner på grund af deres mekaniske egenskaber, høj biokompatibilitet, og langsigtet holdbarhed4. Ikke desto mindre er Ti-implantater et bioinertmateriale og udgør derfor en dårlig evne til at binde sig til det omgivende knoglevæv5. Af denne grund undersøges titaniumændringer for at forbedre deres ydeevne ved at opnå et mere funktionelt mikromiljø på overfladen4,6,7. I denne forstand kan elbiler forankres til titanium ved kemiske8 eller fysiske interaktioner9,10. Immobiliserede elbiler, der stammer fra stamceller eller makrofager, forbedrer Ti's bioaktivitet ved at fremme cellulær vedhæftning og spredning og derved fremkalde en osteogen effekt8,9,10.
Denne artikel vil fokusere på en drop casting strategi for belægning Ti overflader med PL-afledte elbiler i detaljer. Derudover vil vi evaluere elbilers frigivelsesprofil fra den coatede overflade over tid og bekræfte dens cellulære biokompatibilitet in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blodplade lysat (PL) er opnået som tidligere beskrevet i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer3 ved hjælp af friske buffy frakker leveret af IdISBa Biobank som udgangsmateriale. Deres anvendelse til det nuværende projekt blev godkendt af den etiske komité (IB 1995/12 BIO).
1. Elbiler isolation fra PL
- Fjernelse af større organer
- Optø PL ved stuetemperatur.
- Centrifug pl ved 1.500 x g i 15 min ved 4 °C. Kassér pelleten, da den indeholder cellerester.
- Supernatanten opsamles, og der udføres to på hinanden følgende centrifugeringer ved 10.000 x g i 30 min ved 4 °C.
BEMÆRK: Pellet svarer til større elbiler såsom mikrovesicles, og i dette tilfælde kasseres den. - Supernatanten filtreres først til 0,8 μm porøs membran og derefter gennem 0,2 μm porøs membran.
BEMÆRK: Disse trin fjerner alle ikke-ønskede elbiler. - Pulje den filtrerede PL og opbevares ved -20 °C indtil brug.
- Størrelse ekskludering kromatografi
- Ekvilibrere kolonnen koblet til kromatografi udstyr med den ønskede strømningshastighed med filtreret PBS.
BEMÆRK: Den anvendte strømningshastighed afhænger af kolonneegenskaberne. i dette tilfælde er den indstillet til 0,5 mL/min. - Læg det forarbejdede PL (5 mL) med en sprøjte på udstyret.
- Indsprøjt PL'en i kolonnen, og begynd at opsamle 5 ML-fraktioner i 15 ML-rør.
- Saml de elbiler berigede fraktioner, og opbevar dem ved -80 °C, indtil de er i brug.
BEMÆRK: Når du udfører eksperimentet for første gang, karakteriseres alle fraktioner ved proteinkvantificering og immundetektion for at bestemme den, der er beriget med elbiler3,11. I dette eksperiment indsamles den 9. brøk. - Vask kromatografisk kolonne med 30 mL 0,2% NaOH-opløsning og opbevar den i 20% ethanolopløsning, når den når ligevægt.
- Ekvilibrere kolonnen koblet til kromatografi udstyr med den ønskede strømningshastighed med filtreret PBS.
Figur 1: Skematisk diagram over pladen Lysat (PL) ekstracellulær vesikel (elbiler) isolation. PL centrifugeres først ved 1.500 x g og derefter ved 10.000 x g for at fjerne større kroppe. Supernatanten filtreres gennem filtre på 0,8 og 0,2 μm. Forarbejdet PL indlæses på kolonnen, og elbiler er adskilt af størrelsesudelukkelseskromatografi. Klik her for at se en større version af dette tal.
2. Karakteristik af elbiler
BEMÆRK: Elbiler karakterisering er nødvendig for at udføre funktionelle undersøgelser12. Elektronmikroskopi eller western blot karakterisering er tidligere blevet rapporteret13. Denne rapport vil fokusere på de væsentlige karakteriseringsteknikker for ti overfladefunktionalisering.
- Nanopartikler Tracking Analysis (NTA)
- Elbilerne fortyndes (1:1000) i 0,2 μm filtreret PBS.
BEMÆRK: For koncentrerede prøver eller for fortyndede prøver vil være uden for rækkevidde til NTA-bestemmelse, og der vil være behov for justering. - Læg 1 mL af de fortyndede elbiler med en sprøjte til NTA-udstyret, og indsprøjt dem i NTA-udstyret.
- Følg producentens protokol for partikelkoncentration og størrelsesfordelingsbestemmelse.
- Elbilerne fortyndes (1:1000) i 0,2 μm filtreret PBS.
- Proteinkoncentration
- Bestem koncentrationen ved hjælp af 1 μL af elbilopløsningen. Mål absorbansen med et spektrofotometer ved en bølgelængde på 280 nm.
BEMÆRK: Elbiler bør have et lavt indhold af proteiner sammenlignet med antallet af partikler. - Følg producentens anvisninger for at få absorbansaflæsningen ved hjælp af spektrofotometeret.
- Bestem koncentrationen ved hjælp af 1 μL af elbilopløsningen. Mål absorbansen med et spektrofotometer ved en bølgelængde på 280 nm.
3. Titanium overfladefunktionalisering
BEMÆRK: I denne metode anvendes bearbejdet titaniumskiver, c.p. klasse IV, en diameter på 6,2 mm og 2 mm højde. Diskene kan manipuleres med Ti pincet, men det er vigtigt ikke at ridse overfladen. Desuden skal den bearbejdede side vende opad under hele processen.
- Ti diske vask
BEMÆRK: Mængden af opløsninger, der anvendes til Ti vask bør være nok til at dække Ti diske. Placer Ti skiver i et glasbæger og hæld opløsninger på dem. Fjern derefter opløsningen ved at dekantere.- Vask Ti implantater med deioniseret (DI) vand, og kassér derefter vandet.
- Vask Ti implantater med ethanol 70%, og derefter dekantere for at fjerne opløsningen.
- Anbring implantaterne i DI-vand og soniker ved 50 °C i 5 min. Kassér vandet.
- Inkuber Ti-implantater i en 40% NaOH-opløsning ved 50 °C i 10 min med agitation. Kassér opløsningen.
FORSIGTIG: NaOH-opløsningen opvarmes under tilberedningen. Opløsningen er ætsende og bør anvendes inde i en røghætte. - Soniker implantaterne i DI vand ved 50 °C i 5 min, og fjern derefter vandet.
- Udfør flere vaske med DI vand (mindst 5), indtil det når til neutral pH. Tjek pH med pH-indikatorer.
- Sonikere implantaterne i DI vand ved 50 °C i 5 min og fjern vandet.
- Inkuber Ti-implantater i en 50% HNO3-opløsning ved 50 °C i 10 min med omrøring. Fjern opløsningen.
FORSIGTIG: HNO3 er et ætsende stof og oxideringsmiddel, og det skal anvendes inde i en røghætte. - Sonikere implantaterne i DI vand ved 50 °C i 5 min. Fjern vandet.
- Udfør flere vaske med DI vand (mindst 5), indtil neutral pH er opnået. Tjek pH med pH-indikatorer.
- Sonikere implantaterne i DI vand ved 50 °C i 5 min. Fjern vandet.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan eksperimentet stoppes ved at opbevare Ti-implantater i en 70% ethanolopløsning.
- Ti passivation
BEMÆRK: Ti passivering trin udføres ved helt at dække Ti diske med de forskellige løsninger i den rækkefølge, der er anført nedenfor. Ti skiver placeres i et glasbæger, og opløsninger hældes forsigtigt på dem. Volumener, der anvendes i alle vasketrin, skal helt dække implantaterne og fjernes via dekanter.- Inkuber Ti-implantaterne i en 30% HNO3-opløsning i 30 min ved stuetemperatur under blid omrøring. Fjern opløsningen.
- Udfør flere vaske med DI vand (mindst 5), indtil det når til neutral pH. Tjek pH med pH-indikatorer.
- Inkuber Ti-implantater natten over ved stuetemperatur i DI-vand.
- Implantaterne tørres af under vakuumforhold ved 40 °C i 10 min.
- Elbiler dropper casting
BEMÆRK: For cellefunktionelle undersøgelser er det vigtigt at arbejde i et cellekulturskab.- Placer Ti-implantaterne i en 96-brønds plade, hvor den bearbejdede side vender op.
BEMÆRK: Hvis implantaterne vendes på hovedet, kan en nål bruges til at sætte dem tilbage. - Optø elbilsløsningen og bland dem med agitation. Brug en vortex til at puls for 3 s.
- Sæt elbilerne ind på Ti-overfladen. I denne undersøgelse placeres dråber på 40 μL elbilers opløsning på Ti for at immobilisere maksimalt 4 x 1011 elbiler pr. implantat i henhold til koncentrationen bestemt af NTA.
- Pladerne, der indeholder ti'en, under vakuumforhold ved 37 °C, indtil dråberne er helt tørre (~2 h).
BEMÆRK: Juster tiden afhængigt af antallet af implantater og det vand, der er til stede i vakuumkammeret.
- Placer Ti-implantaterne i en 96-brønds plade, hvor den bearbejdede side vender op.
Figur 2: Skematisk diagram over ti passivation og elbiler funktionalisering ved drop casting. Ti-implantater er passiveret først ved inkubation i 30 min i en 30% HNO3-opløsning ved stuetemperatur. Efter flere vasker med DI vand, pH når neutral. Derefter inkuberes Ti-implantater natten over ved stuetemperatur i DI-vand. Derefter tørres implantaterne af under vakuumforhold ved 40 °C. Til immobilisering af elbiler deponeres 40 μL elbiler på Ti-implantater. Dernæst inkuberes implantater ved vakuum i 2 timer, indtil elbiler er fysisk bundet til overfladen. Klik her for at se en større version af dette tal.
4. Ti overfladekarakterisering
- Release undersøgelse
- Inkuberes Ti overflade med 200 μL af filtreret PBS ved 37 °C.
BEMÆRK: PBS filtreres for at undgå interferens med NTA-målingen. - Udskift PBS på forskellige tidspunkter, og opbevar ved -80 °C.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev 2-, 6-, 10- og 14-dages tid punkter analyseret. - Analyser lagret PBS til partikelundersøgelser af NTA i henhold til producentens anvisninger.
BEMÆRK: Partikelkoncentration i PBS på forskellige tidspunkter er en repræsentation af elbilers frigivelsesprofil over tid.
- Inkuberes Ti overflade med 200 μL af filtreret PBS ved 37 °C.
- Biokompatibilitetsundersøgelser
BEMÆRK: Human navlestrengsafledte mesenkymale stamceller (hUC-MSC) er hentet fra IdISBa Biobank i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer.- Vedligehold hUC-MSC i DMEM lav glukose suppleret med 20% FBS indtil brug. Skift medium to gange om ugen.
- Til cellesåning vaskes cellerne i kolber med 5 mL PBS to gange.
- Trypsinize hUC-MSC ved at tilføje 1 mL trypsin løsning. Sørg for, at det helt dækker monolag af celler. Prøveopløsningen fjernes, og placer cellekulturkolben ved 37 °C i 2 min. Vis celleud løsrivelse under mikroskopet. Afrevne celler vises rundt i form og vil være i suspension.
- Resuspend celler i DMEM lav glukose med 1% elbiler udtømt FBS.
BEMÆRK: Forbered medier suppleret med 1% FBS, og derefter ultracentrifuge ved 120.000 x g i 18 timer for at fjerne FBS-elbiler. Det er vigtigt at fjerne elbiler for at undgå interferens med blodplade-elbiler. - Bestem cellekoncentration ved at tælle antallet af celler med et Neubauer-kammer14.
- HUC-MSC til en koncentration på 50.000 celler/mL.
- Frø 200 μL af celleopløsningen på Ti-implantaterne.
- Efter 48 timer opsamles 50 μL medier og udfører den cytotoksiske bestemmelse ved hjælp af Laktatdehydrogenase (LDH) aktivitetssæt i henhold til producentens protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden i denne artikel gør det muligt at opnå elbiler funktionaliserede titanium diske. Elbiler er fysisk bundet til overfladen, hvilket giver mulighed for en vedvarende frigivelse over tid. Mængden af frigivne elbiler kan måles ved NTA på dag 2, 6, 10 og 14. De første målinger på dag 2 viser, at omkring 109 elbiler frigives, efterfulgt af en vedvarende frigivelse på dag 6 (~ 108 elbiler); dag 10 (~ 107 elbiler), og dag 14 (~ 107 elbiler). Dette bekræfter en vedvarende frigivelse, på trods af at vise et fald i mængden af elbiler frigivet over tid.
Figur 3: Akkumulerings-EV-frigivelse af tifunktionaliserede overflader. Partikler blev frigivet i PBS på dag 2, 6, 10 og 14 ved 37 °C. Data repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM med n = 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Desuden viser biokompatibilitetsundersøgelser udført på MSC, at der efter 48 h cellevækst på Ti- og Ti-EVs blev observeret en forbedring af biokompatibiliteten i Ti-EL-køretøjer sammenlignet med Ti-kontrolgruppen, hvilket fremgår af ti-EV-gruppens lavere LDH-aktivitetsniveauer sammenlignet med Ti-gruppen. Medier blev indsamlet efter 48 timers cellevækst på implantater. Celler dyrket direkte på vævskultur plast blev brugt som en negativ kontrol med 0% LDH aktivitet, mens celler behandlet med 1% Triton X-100 blev brugt som en positiv kontrol med 100% cytotoksicitet.
Figur 4: In vitro cell biokompatibilitet af ti-elbiler. LDH-aktivitet blev målt i kulturmedier 48 timer efter cellesåning på implantaterne. Celler seedet på vævskultur plast blev sat som 0% af toksicitet, mens celler seedet på væv kultur plast og behandlet med triton X-100 1% blev fastsat som 100% af toksicitet. En stiplet linje vises ved 30%, hvilket er den maksimale værdi, der accepteres for cytotoksicitet af medicinsk udstyr i henhold til ISO-10993:5. Data repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM, med n = 15 (tre uafhængige eksperimenter blev udført). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol har til formål at give klare instruktioner til elbiler funktionalisering på Ti overflader. Den præsenterede metode er baseret på en drop casting strategi, som er en fysioterapeutption type funktionalisering. Dårlig bibliografi eksisterer med hensyn til elbiler funktionalisering på Ti overflader, selv om der er få undersøgelser, der viser forskellige fordele ved at immobilisere elbiler på Ti10. Anyway, nogle af de undersøgte strategier omfatter biokemisk bindende8, polymer entrapment9 eller drop casting10. Selv om brugen af kemiske belægninger gennem kovalente bindinger kan opnå en mere homogen belægning med en højere grad af funktionalisering, kemiske reaktioner kan skade elbiler struktur og funktionalitet15. Drop casting er en nem og billig metode sammenlignet med polymer entrapment eller biokemisk binding.
Et vigtigt punkt i protokollen, der kan løses, er EV-kilden. I denne undersøgelse er elbiler fremstillet fra PL. Drop casting-metoden kan dog tilpasses enhver form for elbiler, da den er baseret på fysiske interaktioner. Tidligere undersøgelser med andre metoder giver positive resultater efter at have evalueret brugen af cellekulturelle elbiler såsom stamceller8,10 eller machropages9. Det er vigtigt, med hensyn til brugen af elbiler, at udføre en fuldstændig karakteristik af dem. International Society of Extracellular Vesicles har til formål at bestemme de fleste af de vigtigste elbiler parametre for at sikre reproducerbarhed på området12. Andre undersøgelser har allerede beskrevet metoden for elbiler karakterisering, således i denne protokol har vi ikke detaljeret den elektroniske mikroskopi og vestlige blot teknik protokoller udført13.
Et kritisk skridt for Ti funktionalisering ved drop casting er den tid og betingelser, der er tilladt for elbiler fysioterapeutption. I protokollen, vi præsenterer, udføres inkubation under vakuumforhold, indtil dråber er helt tørke. Normalt er 2 timer nødvendige for at sikre vandfordampning ved 37 °C og under vakuumforhold. Antallet af implantater, der funktionaliseres, kan dog øge den tid, der er nødvendig for at sikre korrekt vedhæftning af elbiler på Ti. Det er vigtigt at sikre, at der ikke er vand tilbage, før du fortsætter med at karakterisere eller funktionelle undersøgelser. Variationer i protokollen for elbiler funktionalisering på Ti kan findes dog i litteraturen. F.eks. er en inkubation fra den ene dag til den anden ved 4 °C uden vakuumforhold allerede blevet undersøgt10. Men i vores hænder førte brugen af denne metode til dårlige resultater sammenlignet med den fuldstændige tør, som vi beskriver.
Selvom det ikke udføres i den nuværende protokol, kan elbilers funktionalisering evalueres gennem forskellige metoder, blandt andet kan ændringer på overfladens vådbarhed være karakteriseret ved at måle vandkontaktvinklen på overfladen; og ændringer i den kemiske karakter af belægningerne ved Fourier-transformeret infrarød (FTIR) spektroskopi koblet til optisk mikroskopi. Desuden kan elbiler farves med specifikke farvestoffer (såsom PKH26 farvestof), og de funktionaliserede overflader kan afbildes ved fluorescensmikroskopi.
Samlet set kan yderligere funktionelle tests udføres for at udforske osteogen funktionalitet af elbiler deposition på Ti. På den ene side kan celle vedhæftning eller vækst assays udført gennem konfokal mikroskopi eller enzymatisk aktivitet være den første tilgang til test funktionalitet10. I dette papir, har vi beskrevet cytotoksicitet assay som en af de første tilgange af implantater virkninger på celler. På den anden side kan PCR-analyser bruges til at bestemme genekspressionen af osteogene markører i cellekultur udført på Ti diske8,9,10. Desuden kan proteindetektering gennem vestlige blot også foreslå en osteogen profil, på trods af at det er en semi kvantitativ teknik. Andre proteindetekteringsteknikker såsom detektionsmatrixer eller enzymatiske kits kan også være gode tilgange til funktionalitetseksperimenternes ydeevne9. En yderligere funktionel analyse er bestemmelse af calciumaflejring gennem Calcein Blue Staining16. Når in vitro-funktionaliteten er blevet bevist, kan yderligere forsøg udføres ved hjælp af dyre moldels8.
Afslutningsvis tillader overfladefunktionalisering et forbedret terapeutisk design af biomaterialer. Kombinationen af elbiler med implantable biomaterialer kan muliggøre vedvarende frigivelse i forbindelse med en forbedring af biokompatibiliteten og osteogene egenskaber ved biomaterialet. Det er vigtigt at undersøge forskellige tilgange til ev-binding; drop casting er således et interessant udgangspunkt for fremtidige undersøgelser, der har til formål at producere klinisk tilgængelige ortopædiske anordninger. Protokollen i dette manuskript har til formål at give en nem og reproducerbar vejledning til fremtidige eksperimenters ydeevne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning er finansieret af Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, medfinansieret af ESF's Europæiske Socialfond og EFRU's Europæiske Fond for Regionaludvikling (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017) og PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finansieret af den bæredygtige turismeskat på De Baleariske Øer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
References
- Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity. European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).
- Antich-Rosselló, M., et al. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).
- Li, Y., et al. New developments of Ti-based alloys for biomedical applications. Materials. 7 (3), Basel, Switzerland. 1709-1800 (2014).
- Lan, W. C., et al. The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors. Applied Sciences. 10 (2), 590 (2020).
- Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. Surface modifications and their effects on titanium dental implants. BioMed Research International. 2015, 791725 (2015).
- Damiati, L., et al. Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants. Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694 (2017).
- Chen, L., et al. Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).
- Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration. Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).
- Wang, X., et al. Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces. Biomaterials. 230, 119571 (2020).
- Lozano-Ramos, I., et al. Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Liu, J., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541 (2018).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2021).
- Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).
- Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).
