Summary
Her presenterer vi en metode for isolering av Extracellular Vesicles (EVs) avledet fra blodplatelysene (PL) og deres bruk for belegg titan (Ti) implantatoverflater. Vi beskriver dråpestøpebeleggmetoden, ELBIL-ene frigjør profil fra overflatene, og in vitro biokompatibilitet av elbiler belagte Ti-overflater.
Abstract
Ekstracellulære Vesicles (ELBILER) er biologiske nanovesikler som spiller en nøkkelrolle i cellekommunikasjon. Innholdet inkluderer aktive biomolekyler som proteiner og nukleinsyrer, som gir stort potensial i regenerativ medisin. Mer nylig har elbiler avledet fra Platelet Lysate (PL) vist en osteogen evne som kan sammenlignes med PL. Dessuten brukes biomaterialer ofte i ortopedi eller tannrestaurering. Her tilbyr vi en metode for å funksjonalisere Ti-overflater med PL-avledede elbiler for å forbedre deres osteogene egenskaper.
Elbiler er isolert fra PL etter størrelseseksklusjonskromatografi, og etterpå er Ti-overflater funksjonalisert med PL-elbiler ved drop casting. Funksjonalisering er bevist ved EVs utgivelse og dens biokompatibilitet av laktat dehydrogenase (LDH) utgivelsesanalyse.
Introduction
Elbiler er membran vesicles (30-200 nm) utskilt av enhver celle og spille en nøkkelrolle i celle-til-celle kommunikasjon ved å levere sin last. De inneholder en rekke aktive biomolekyler som kan omfatte nukleinsyrer, vekstfaktorer eller bioaktive lipider1. Av disse grunnene har elbiler blitt evaluert for deres potensielle bruk i terapeutiske behandlinger. Når det gjelder ortopedi og benregenerering, har elbiler fra forskjellige kilder blitt testet. Blant dem har blodplater-avledede elbiler vist seg å indusere en differensieringseffekt på stamceller samtidig som de opprettholder en lav cytotoksisk profil2,3. Derfor er det nødvendig med videre forskning for å utforske muligheten for å kombinere elbiler med biomaterialer for å kunne bruke dem i daglig klinisk praksis.
Titanbaserte biomaterialer er mye brukt som stillaser for beinheling kliniske intervensjoner på grunn av deres mekaniske egenskaper, høy biokompatibilitet og langsiktig holdbarhet4. Likevel er Ti-implantater et bioinert materiale og presenterer derfor en dårlig evne til å binde seg til det omkringliggende beinvevet5. Av denne grunn studeres titanmodifikasjoner for å forbedre ytelsen ved å oppnå et mer funksjonelt mikromiljø på overflaten4,6,7. I denne forstand kan elbiler forankres til titan ved kjemisk8 eller fysiske interaksjoner9,10. Immobiliserte elbiler avledet fra stamceller eller makrofager forbedrer bioaktiviteten til Ti ved å fremme cellulær vedheft og spredning og dermed indusere en osteogen effekt8,9,10.
Denne artikkelen vil fokusere på en drop casting strategi for belegg Ti overflater med PL-avledede elbiler i detalj. I tillegg vil vi evaluere EVs utgivelsesprofil fra den belagte overflaten over tid og bekrefte dens cellulære biokompatibilitet in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Platelet Lysate (PL) er innhentet som tidligere beskrevet i samsvar med institusjonelle retningslinjer3 ved hjelp av ferske buffy strøk levert av IdISBa Biobank som startmateriale. Deres bruk for det nåværende prosjektet ble godkjent av Etikkutvalget (IB 1995/12 BIO).
1. EVs isolasjon fra PL
- Fjerning av større kropper
- Tine PL ved romtemperatur.
- Sentrifuge PL ved 1500 x g i 15 min ved 4 °C. Kast pelletsen da den inneholder cellerester.
- Samle supernatanten og utfør to påfølgende sentrifuger ved 10.000 x g i 30 min ved 4 °C.
MERK: Pellet tilsvarer større elbiler som mikrovesicles, og i dette tilfellet kastes den. - Filtrer supernatanten først gjennom 0,8 μm porøs membran, og deretter gjennom 0,2 μm porøs membran.
MERK: Disse trinnene fjerner alle ikke-ønskede elbiler. - Slå sammen den filtrerte PL-en og oppbevar den ved -20 °C til bruk.
- Kromatografi for utelukkelse av størrelse
- Likevekt kolonnen koblet til kromatografiutstyr ved ønsket strømningshastighet med filtrert PBS.
MERK: Strømningshastigheten som brukes, avhenger av kolonneegenskapene; I dette tilfellet er den satt til 0,5 ml/min. - Last den bearbeidede PL (5 ml) med en sprøyte til utstyret.
- Injiser PL i kolonnen og begynn å samle 5 ml fraksjoner i 15 ml rør.
- Samle elbilene beriket brøkdeler og lagre dem ved -80 °C til bruk.
MERK: Når du utfører eksperimentet for første gang, karakteriser alle fraksjoner ved protein kvantifisering og immunodeteksjon for å bestemme den som er beriket med EVs3,11. I dette eksperimentet samles den ninde brøkdelen. - Vask den kromatografiske kolonnen med 30 ml 0,2% NaOH-oppløsning og oppbevar den i 20% etanoloppløsning når den når likevekt.
- Likevekt kolonnen koblet til kromatografiutstyr ved ønsket strømningshastighet med filtrert PBS.
Figur 1: Skjematisk diagram over isolering av blodplatelysat (PL) ekstracellulær vesicle (EVs). PL sentrifugeres først på 1500 x g, og deretter ved 10.000 x g for å fjerne større kropper. Supernatanten filtreres gjennom 0,8 og 0,2 μm filtre. Behandlet PL lastes inn i kolonnen, og elbiler skilles etter størrelseseksklusjonskromatografi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. EVs karakterisering
MERK: EVs karakterisering er nødvendig for å utføre funksjonelle studier12. Elektronmikroskopi eller vestlig blot karakterisering har tidligere blitt rapportert13. Denne rapporten vil fokusere på de essensielle karakteriseringsteknikkene for Ti overflatefunksjonalisering.
- Nanopartikkelsporingsanalyse (NTA)
- Fortynn ELBILene (1:1000) i 0,2 μm filtrert PBS.
MERK: For konsentrerte prøver eller for fortynnede prøver vil være utenfor rekkevidde for NTA-bestemmelse, og justering vil være nødvendig. - Last 1 ml av de fortynnede ELBIL-ene med en sprøyte til NTA-utstyret og injiser dem i NTA-utstyret.
- Følg produsentens protokoll for partikkelkonsentrasjon og størrelsesfordelingsbestemmelse.
- Fortynn ELBILene (1:1000) i 0,2 μm filtrert PBS.
- Proteinkonsentrasjon
- Bestem konsentrasjonen ved hjelp av 1 μL av EVs-løsningen. Mål absorbansen med et spektrofotometer ved en bølgelengde på 280 nm.
MERK: Elbiler bør presentere lave nivåer av proteiner sammenlignet med antall partikler. - Følg produsentens instruksjoner for å få absorbansavlesningen ved hjelp av spektrofotometeret.
- Bestem konsentrasjonen ved hjelp av 1 μL av EVs-løsningen. Mål absorbansen med et spektrofotometer ved en bølgelengde på 280 nm.
3. Titan overflatefunksjonalisering
MERK: I denne metoden brukes bearbeidede titanskiver, c.p. grad IV, 6,2 mm diameter og 2 mm høyde. Platene kan manipuleres med Ti pinsett, men det er viktig å ikke skrape overflaten. Videre må den bearbeidede siden vende oppover under hele prosessen.
- Ti plater vaskes
MERK: Volumet av løsninger som brukes til Ti-vask bør være nok til å dekke Ti-plater. Legg Ti-plater i et glassbeger og hell oppløsninger på dem. Fjern deretter løsningen ved å dekantere.- Vask Ti implantater med deionisert (DI) vann, og kast deretter vannet.
- Vask Ti-implantater med etanol 70%, og dekanter deretter for å fjerne løsningen.
- Plasser implantatene i DI-vann og soniker ved 50 °C i 5 minutter. Kast vannet.
- Inkuber Ti-implantater i en 40 % NaOH-oppløsning ved 50 °C i 10 minutter med agitasjon. Kast oppløsningen.
FORSIKTIG: NaOH-oppløsningen varmes opp under tilberedningen. Løsningen er etsende og bør brukes inne i en avtrekkshette. - Soniker implantatene i DI-vann ved 50 °C i 5 minutter, og fjern deretter vannet.
- Utfør flere vasker med DI-vann (minst 5) til det når til nøytral pH. Kontroller pH med pH-indikatorer.
- Soniker implantatene i DI-vann ved 50 °C i 5 minutter og fjern vannet.
- Inkuber Ti-implantater i en 50 % HNO3-oppløsning ved 50 °C i 10 minutter med agitasjon. Fjern løsningen.
FORSIKTIG: HNO3 er et etsende og oksidasjonsmiddel, og det bør brukes inne i en avtrekkshette. - Soniker implantatene i DI-vann ved 50 °C i 5 minutter. Fjern vannet.
- Utfør flere vasker med DI-vann (minst 5) til nøytral pH er oppnådd. Kontroller pH med pH-indikatorer.
- Soniker implantatene i DI-vann ved 50 °C i 5 minutter. Fjern vannet.
MERK: På dette tidspunktet kan eksperimentet stoppes ved å lagre Ti-implantater i en 70% etanolløsning.
- Ti passivasjon
MERK: Ti passivation trinn utføres ved å fullstendig dekke Ti plater med de forskjellige løsningene i rekkefølgen som er oppført nedenfor. Ti plater er plassert i et glassbeger og løsninger helles forsiktig på dem. Volumer som brukes i alle vasketrinn må dekke implantatene fullstendig og fjernes via dekantering.- Inkuber Ti-implantatene i en 30% HNO3-løsning i 30 min ved romtemperatur under skånsom agitasjon. Fjern løsningen.
- Utfør flere vasker med DI-vann (minst 5) til det når til nøytral pH. Kontroller pH med pH-indikatorer.
- Inkuber Ti-implantater over natten ved romtemperatur i DI-vann.
- Tørk av implantatene under vakuumforhold ved 40 °C i 10 minutter.
- Elbiler dropper støping
MERK: For cellefunksjonelle studier er det viktig å jobbe i et cellekulturskap.- Plasser Ti-implantatene i en 96-brønnsplate, med den bearbeidede siden vendt opp.
MERK: Hvis implantatene snus opp-ned, kan en nål brukes til å sette dem tilbake. - Tine ELBIL-løsningen og bland dem med agitasjon. Bruk en virvel til å pulse i 3 s.
- Deponer ELBIL-ene på Ti-overflaten. I denne studien plasseres dråper på 40 μL av ELBILER-løsningen på Ti for å immobilisere maksimalt 4 x 1011 elbiler per implantat i henhold til konsentrasjonen bestemt av NTA.
- Plasser platene som inneholder Ti under vakuumforhold ved 37 °C til dråpene er helt tørre (~2 t).
MERK: Juster tiden avhengig av antall implantater og vannet som finnes i vakuumkammeret.
- Plasser Ti-implantatene i en 96-brønnsplate, med den bearbeidede siden vendt opp.
Figur 2: Skjematisk diagram over Ti passivation og EVs funksjonalisering ved drop casting. Ti implantater passiviseres først ved inkubasjon i 30 min i en 30% HNO3 løsning ved romtemperatur. Etter flere vasker med DI-vann når pH nøytral. Deretter inkuberes Ti-implantater over natten ved romtemperatur i DI-vann. Deretter tørkes implantatene av under vakuumforhold ved 40 °C. For immobilisering av elbiler blir 40 μL elbiler avsatt på Ti-implantater. Deretter inkuberes implantater ved vakuum i 2 timer til elbiler er fysisk bundet til overflaten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Ti overflatekarakterisering
- Utgivelsesstudie
- Inkuber Ti overflate med 200 μL filtrert PBS ved 37 °C.
MERK: PBS filtreres for å unngå forstyrrelser i NTA-målingen. - Skift ut PBS på forskjellige tidspunkter og oppbevar den ved -80 °C.
MERK: I denne studien ble 2-, 6-, 10- og 14-dagers tidspoeng analysert. - Analyser lagret PBS for partikkelstudier av NTA i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Partikkelkonsentrasjon i PBS på forskjellige tidspunkter er en representasjon av EVs utgivelsesprofil over tid.
- Inkuber Ti overflate med 200 μL filtrert PBS ved 37 °C.
- Biokompatibilitetsstudier
MERK: Humane navlestrengsavledede mesenchymale stamceller (hUC-MSC) er hentet fra IdISBa Biobank i samsvar med institusjonelle retningslinjer.- Vedlikehold hUC-MSC i DMEM lav glukose supplert med 20% FBS til bruk. Endre medium to ganger i uken.
- For cellesåing, vask cellene i kolber med 5 ml PBS to ganger.
- Prøv hUC-MSC ved å legge til 1 ml trypsinløsning. Forsikre deg om at den helt dekker monolayer av celler. Fjern trypsinoppløsningen og plasser cellekulturflasken ved 37 °C i ca. 2 minutter. Vis celleavløsning under mikroskopet. Frakoblede celler vises runde i form og vil være i suspensjon.
- Resuspendceller i DMEM lav glukose med 1% elbiler utarmet FBS.
MERK: Forbered medier supplert med 1% FBS, og deretter ultracentrifuge på 120,000 x g i 18 timer for å fjerne FBS-elbiler. Det er viktig å fjerne elbiler for å unngå forstyrrelser med blodplater. - Bestem cellekonsentrasjon ved å telle antall celler med et Neubauer-kammer14.
- Bring hUC-MSC til en konsentrasjon på 50 000 celler/ml.
- Frø 200 μL av celleløsningen på Ti-implantatene.
- Etter 48 timer samler du 50 μL medier og utfører cytotoksisk bestemmelse ved hjelp av laktat dehydrogenase (LDH) aktivitetssett, i henhold til produsentens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden som presenteres i denne artikkelen gjør det mulig å skaffe EVs funksjonaliserte titanplater. Elbiler er fysisk bundet til overflaten, noe som gir en vedvarende frigjøring over tid. Mengden elbiler som slippes kan måles med NTA på dag 2, 6, 10 og 14. De første målingene, på dag 2, viser at rundt 109 elbiler slippes, etterfulgt av en vedvarende utgivelse på dag 6 (~108 elbiler); dag 10 (~107 elbiler) og dag 14 (~107 elbiler). Dette bekrefter en vedvarende utgivelse, til tross for at det viser en nedgang i mengden elbiler som slippes ut over tid.
Figur 3: Akkumulerende EV-frigjøring av Ti-funksjonaliserte overflater. Partikler ble sluppet ut i PBS på dag 2, 6, 10 og 14 ved 37 °C. Data representerer gjennomsnittet ± SEM med n = 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Videre viser biokompatibilitetsstudier utført på MSC at etter 48 timers cellevekst på Ti og Ti-EVs ble det observert en forbedring i biokompatibilitet hos Ti-elbiler sammenlignet med Ti-kontrollgruppen, vist av de lavere LDH-aktivitetsnivåene til Ti-EV-gruppen sammenlignet med Ti-gruppen. Media ble samlet inn etter 48 timers cellevekst på implantater. Celler dyrket direkte på vevskultur plast ble brukt som en negativ kontroll med 0% LDH aktivitet, mens celler behandlet med 1% Triton X-100 ble brukt som en positiv kontroll med 100% cytotoksisitet.
Figur 4: In vitrocellebiokompatibilitet for Ti-elbiler. LDH-aktivitet ble målt i kulturmedier 48 timer etter cellesåing på implantatene. Celler frøet på vevskultur plast ble satt som 0% av toksisitet mens celler frøet på vev kultur plast og behandlet med triton X-100 1% ble satt som 100% av toksisitet. En stiplet linje vises på 30%, som er den maksimale verdien akseptert for cytotoksisitet av medisinsk utstyr i henhold til ISO-10993:5. Data representerer gjennomsnittet ± SEM, med n = 15 (tre uavhengige eksperimenter ble utført). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen tar sikte på å gi klare instruksjoner for EVs funksjonalisering på Ti overflater. Metoden som presenteres er basert på en drop casting-strategi, som er en fyseorpsjonstype funksjonalisering. Det finnes dårlig bibliografi når det gjelder EVs funksjonalisering på Ti-overflater, selv om det er få studier som viser forskjellige fordeler ved å immobilisere elbiler på Ti10. Uansett inkluderer noen av strategiene som utforskes biokjemisk binding8, polymer entrapment9 eller drop casting10. Selv om bruk av kjemiske belegg gjennom kovalente bindinger kan oppnå et mer homogent belegg med høyere grad av funksjonalisering, kan kjemiske reaksjoner skade ELBIL-strukturen og funksjonaliteten15. Drop casting er en enkel og rimelig metode sammenlignet med polymer entrapment eller biokjemisk binding.
Et viktig punkt i protokollen som kan adresseres er EV-kilden. I denne studien er elbiler hentet fra PL. Imidlertid er drop casting-metoden tilpasningsdyktig til alle slags elbiler, siden den er basert på fysiske interaksjoner. Tidligere studier med andre metoder gir positive resultater etter evaluering av bruk av cellekulturerte elbiler som stamceller8,10 eller machropages9. Det er viktig, når det gjelder bruk av elbiler, å utføre en fullstendig karakterisering av dem. International Society of Extracellular Vesicles har som mål å bestemme de fleste av de viktigste ELBIL-parametrene for å sikre reproduserbarhet i feltet12. Andre studier har allerede beskrevet metodikken for EVs karakterisering, og i denne protokollen har vi ikke detaljert de elektroniske mikroskopi- og vestlige blotteknikkprotokollene som utføres13.
Et kritisk skritt for Ti-funksjonalisering ved drop casting er tiden og betingelsene som er tillatt for EVs fyseorpsjon. I protokollen vi presenterer, utføres inkubasjon under vakuumforhold til dråper er helt tørke. Vanligvis er det nødvendig med 2 timer for å sikre vannfordampning ved 37 °C og under vakuumforhold. Imidlertid kan antall implantater som blir funksjonalisert øke tiden som trengs for å sikre riktig vedheft av elbiler på Ti. Det er viktig å sørge for at det ikke blir igjen vann før du går videre til karakterisering eller funksjonelle studier. Variasjoner i protokollen for elbilers funksjonalisering på Ti finnes imidlertid i litteraturen. For eksempel er en overnatting inkubasjon ved 4 °C uten vakuumforhold allerede utforsket10. Men i våre hender førte bruken av denne metoden til dårlige resultater sammenlignet med den komplette tørre som vi beskriver.
Selv om det ikke utføres i den nåværende protokollen, kan EVs funksjonalisering evalueres gjennom forskjellige metoder, blant annet kan endringer på overflatens fuktbarhet være preget av å måle vannkontaktvinkelen på overflaten; og endringer i beleggets kjemiske karakter av Fourier-transformert infrarød (FTIR) spektroskopi kombinert med optisk mikroskopi. Videre kan elbiler bli farget med spesifikke fargestoffer (som PKH26 fargestoff), og de funksjonaliserte overflatene kan bli avbildet av fluorescensmikroskopi.
Totalt sett kan ytterligere funksjonelle tester utføres for å utforske den osteogene funksjonaliteten til elbilers avsetning på Ti. På den ene siden kan celleadhesjon eller vekstanalyser utført gjennom konfektmikroskopi eller enzymatisk aktivitet være den første tilnærmingen til testfunksjonalitet10. I dette dokumentet har vi beskrevet cytotoksisitetsanalysen som en av de første tilnærmingene til implantatenes effekter på celler. På den annen side kan PCR-analyser brukes til å bestemme genuttrykket til osteogene markører i cellekultur utført på Ti-plater8,9,10. Videre kan proteindeteksjon gjennom vestlig blot også foreslå en osteogen profil, til tross for at det er en semi kvantitativ teknikk. Andre proteindeteksjonsteknikker som deteksjonsmatriser eller enzymatiske sett kan også være gode tilnærminger for funksjonalitetseksperimentenes ytelse9. En ekstra funksjonell analyse er bestemmelse av kalsiumavsetning gjennom Calcein Blue Staining16. Når in vitro-funksjonalitet er bevist, kan ytterligere eksperimenter utføres ved hjelp av dyr moldels8.
Til slutt tillater overflatefunksjonalisering en forbedret terapeutisk design av biomaterialer. Kombinasjonen av elbiler med implanterbare biomaterialer kan tillate vedvarende frigjøring knyttet til en forbedring av biokompatibilitet og osteogene egenskaper til biomaterialet. Det er viktig å utforske ulike tilnærminger for EV-binding; Drop casting er derfor et interessant utgangspunkt for fremtidige studier som tar sikte på å produsere klinisk tilgjengelige ortopediske enheter. Protokollen som presenteres i dette manuskriptet tar sikte på å gi en enkel og reproduserbar guide for fremtidige eksperimenters ytelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, finansiert av ESF European Social Fund og ERDF European Regional Development Fund (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017) og PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finansiert av den bærekraftige turistskatten på Balearene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
References
- Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity. European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).
- Antich-Rosselló, M., et al. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).
- Li, Y., et al. New developments of Ti-based alloys for biomedical applications. Materials. 7 (3), Basel, Switzerland. 1709-1800 (2014).
- Lan, W. C., et al. The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors. Applied Sciences. 10 (2), 590 (2020).
- Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. Surface modifications and their effects on titanium dental implants. BioMed Research International. 2015, 791725 (2015).
- Damiati, L., et al. Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants. Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694 (2017).
- Chen, L., et al. Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).
- Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration. Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).
- Wang, X., et al. Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces. Biomaterials. 230, 119571 (2020).
- Lozano-Ramos, I., et al. Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Liu, J., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541 (2018).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2021).
- Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).
- Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).
