Análisis de los productos de escisión familiar del factor de crecimiento transformador ß secretados en el blastocoele de los embriones de Xenopus laevis
Summary
Cuando las proteínas precursoras de la familia ß del factor de crecimiento transformador se expresan ectópicamente en embriones de Xenopus laevis, se dimerizan, se escindin y se secretan en el blastocele, que comienza en la etapa de blástula tardía a la gastrula temprana. Describimos un método para aspirar productos de escisión de la cavidad del blastocoele para el análisis de inmunoblot.
Abstract
Los dos brazos de la superfamilia del factor de crecimiento transformador ß (Tgfß), representados por ligandos Tgfß/Nodal o de proteína morfogenética ósea (Bmp), respectivamente, desempeñan un papel esencial en el desarrollo embrionario y la homeostasis adulta. Los miembros de la familia Tgfß se hacen como precursores inactivos que se dimerizan y se pliegan dentro del retículo endoplásmico. El precursor se divide posteriormente en fragmentos de ligando y prodominio. Aunque solo el ligando dimérico puede activar los receptores Tgfß y activar la señalización aguas abajo, existe un creciente reconocimiento de que la fracción prodominio contribuye a la actividad del ligando. Este artículo describe un protocolo que se puede utilizar para identificar los productos de escisión generados durante la activación de las proteínas precursoras de Tgfß. Los precursores de Tgfß que codifican arnés se microinyectan primero en embriones de X. laevis. Al día siguiente, los productos de escisión se recogen del blastocoele de los embriones en etapa de gastrula y se analizan en Western blots. Este protocolo se puede completar con relativa rapidez, no requiere reactivos costosos y proporciona una fuente de productos concentrados de escisión Tgfß en condiciones fisiológicas.
Introduction
Los miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformador ß (Tgfß) se sintetizan como proteínas precursoras inactivas y dimerizadas. Los precursores son luego escindidos por miembros de la familia de la proproteína convertasa (PC), ya sea dentro de la vía secretora o fuera de las células. Esto crea un dímero de ligando activo unido por disulfuro y dos fragmentos de prodominio1. Aunque se sabe desde hace más de 30 años que el prodominio de los precursores de la familia Tgfß es necesario para generar un ligando activo2,la comprensión de cómo los prodominios contribuyen a la función del ligando es incompleta.
Aunque la comprensión del proceso de activación proteolítica de los miembros de la familia Tgfß sigue siendo incompleta, existe un creciente interés en comprender qué motivos de consenso de PC se escindin in vivo,si la escisión ocurre en un compartimento subcelular o extracelular específico, y si el prodominio permanece covalente o no covalentemente asociado con el ligando escindido3. Diversos estudios han demostrado que el prodominio no solo guía el plegamiento del ligando antes de la escisión4,5,sino que también puede influir en la estabilidad del factor de crecimiento y el rango de acción6,7,8,9,impulsar la formación de homodímeros o heterodímeros10,anclar el ligando en la matriz extracelular para mantener la latencia del ligando11,y en algunos casos, funcionar como un ligando por derecho propio para activar heterólogos. señalización12. Las mutaciones puntuales heterocigotas dentro del prodominio de muchos miembros de la familia Tgfß se asocian con defectos oculares, óseos, renales, esqueléticos u otros en humanos3. Estos hallazgos resaltan el papel crítico del prodominio en la generación y el mantenimiento de un ligando activo y enfatizan la importancia de identificar y descifrar el papel de los productos de escisión desarrollados durante la maduración proteolítica de los precursores de la familia Tgfß.
Aquí describimos un protocolo detallado para aspirar productos de escisión generados durante la maduración de precursores de la familia Tgfß a partir del blastocoele de embriones de X. laevis y luego analizarlos en inmunoblots. Este protocolo se puede utilizar para determinar si uno o más motivos de consenso de PC en una proteína precursora se escinden in vivo10,13, identificar los PC endógenos que escinden cada motivo 13 ,14,comparar la formación in vivo de homodímeros de la familia Tgfß versus heterodímeros10 o analizar si las mutaciones puntuales asociadas a enfermedades humanas en precursores de Tgfß afectan su capacidad para formar ligandos diméricos funcionales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las principales ventajas del protocolo descrito aquí son que se puede completar con relativa rapidez, no requiere reactivos costosos y proporciona una fuente de productos concentrados de escisión Tgfß en condiciones fisiológicas. Otra ventaja es que permite analizar las proteínas marcadas con epítopos y así eludir la escasez de anticuerpos disponibles comercialmente que reconocen la mayoría de los prodominios de la familia Tgfß. Aunque también es posible analizar la escisión de las proteínas precursoras de Tg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Mary Sánchez por el excelente cuidado de los animales. La investigación de los autores está respaldada por el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano de los Institutos Nacionales de Salud (NIH / NICHD) otorga R01HD067473-08 y R21 HD102668-01 y por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK / NIH) subvención R01DK128068-01.
Materials
| ß-mercaptoethanol | Fisher | AC125470100 | |
| Bromophenol Blue | Fisher | B392-5 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C79-500 | |
| Calcium Nitrate | Fisher | C109-500 | |
| Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder | Fisher | 12-141-364 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science tools | 11251-10 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Glass capillary, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Injection Syringe, 1 mL | Fisher | 8881501368 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Needle, 26 G | Fisher | 305111 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
| Picoliter Microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette Puller | Narashige | PC-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| PVDF Membrane | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S271-10 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tricaine-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
References
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