Мезоскопическая оптическая визуализация всего сердца мыши
Summary
Мы сообщаем о методе мезоскопической реконструкции всего сердца мыши, сочетая новые достижения в области трансформации и окрашивания тканей с разработкой осевого сканируемого светового листового микроскопа.
Abstract
Как генетические, так и негенетические сердечные заболевания могут вызывать тяжелые процессы ремоделирования в сердце. Структурное ремоделирование, такое как отложение коллагена (фиброз) и клеточное смещение, может повлиять на электрическую проводимость, привести к электромеханическим дисфункциям и, в конечном итоге, привести к аритмии. Современные прогностические модели этих функциональных изменений основаны на неинтегрированной структурной информации с низким разрешением. Размещение этой структуры на другом порядке величины является сложной задачей из-за неэффективности стандартных методов визуализации при выполнении визуализации высокого разрешения в массивной ткани. В этой работе мы описываем методологическую основу, которая позволяет визуализировать целые сердца мыши с микрометрическим разрешением. Достижение этой цели потребовало технологических усилий, в которых были объединены достижения в области трансформации тканей и методов визуализации. Во-первых, мы описываем оптимизированный протокол CLARITY, способный превращать неповрежденное сердце в нанопористую, гидрогеле-гибридизированную, безлипидную форму, которая обеспечивает высокую прозрачность и глубокое окрашивание. Затем описывается флуоресцентный световой микроскоп, способный быстро получать изображения мезоскопического поля зрения (в масштабе мм) с микронным разрешением. Следуя проекту mesoSPIM, задуманный микроскоп позволяет реконструировать все сердце мыши с микрометрическим разрешением в одном томографическом сканировании. Мы считаем, что эта методологическая основа позволит прояснить участие цитоархитектуры в электрических дисфункциях и проложить путь к комплексной модели, которая учитывает как функциональные, так и структурные данные, что позволит провести единое исследование структурных причин, которые приводят к электрическим и механическим изменениям после ремоделирования тканей.
Introduction
Структурное ремоделирование, связанное с сердечными заболеваниями, может влиять на электропроводность и вводить электромеханические дисфункции органа 1,2. Современные подходы, используемые для прогнозирования функциональных изменений, обычно используют МРТ и DT-МРТ для получения общей реконструкции отложения фиброза, сосудистого дерева и распределения волокон сердца, и они используются для моделирования путей распространения потенциала предпочтительного действия (APP) через орган 3,4. Эти стратегии могут дать прекрасный обзор организации сердца. Однако их пространственное разрешение недостаточно для исследования влияния структурного ремоделирования на сердечную функцию на клеточном уровне.
Размещение этой структуры в другом порядке величины, где отдельные клетки могут играть индивидуальные роли в распространении потенциала действия, является сложной задачей. Основным ограничением является неэффективность стандартных методов визуализации для выполнения визуализации с высоким разрешением (микрометрическое разрешение) в массивных (сантиметровых) тканях. На самом деле, визуализация биологических тканей в 3D с высоким разрешением очень сложна из-за непрозрачности тканей. Наиболее распространенным подходом к выполнению 3D-реконструкций целых органов является подготовка тонких срезов. Однако точное секционирование, сборка и визуализация требуют значительных усилий и времени. Альтернативный подход, который не требует разрезания образца, заключается в создании прозрачной ткани. За последние годы было предложено несколько методик осветления тканей 5,6,7,8. Задача производства массивных, прозрачных и флуоресцентно меченых тканей была недавно достигнута путем разработки истинных подходов к трансформации тканей (CLARITY9, SHIELD10). В частности, метод CLARITY основан на превращении интактной ткани в нанопористую, гидрогелегибридизированную, безлипидную форму, что позволяет придать высокую прозрачность путем селективного удаления мембранных липидных бислоев. Примечательно, что этот метод был признан успешным также в кардиологической подготовке 11,12,13,14. Однако, поскольку сердце слишком хрупко, чтобы быть пригодным для активного очищения, оно должно быть очищено с использованием пассивного подхода, который требует длительного времени для придания полной прозрачности.
В сочетании с передовыми методами визуализации, такими как микроскопия светового листа, CLARITY имеет потенциал для изображения 3D-массивных тканей сердца с микрометрическим разрешением. В световой микроскопии освещение образца выполняется тонким листом света, ограниченным в фокальной плоскости объекта обнаружения. Флуоресцентное излучение собирается вдоль оси, перпендикулярной плоскости15 освещения. Архитектура обнаружения похожа на широкоугольную микроскопию, что делает сбор намного быстрее, чем лазерные сканирующие микроскопы. Перемещение образца по световому листу позволяет получить полную томографию крупных образцов, размером до сантиметра. Однако из-за внутренних свойств пучка Гаусса можно получить очень тонкий (порядка нескольких микрон) световой лист только для ограниченного пространственного расширения, тем самым резко ограничивая поле зрения (FoV). Недавно была введена новая схема возбуждения для преодоления этого ограничения и применена для визуализации мозга, позволяющая проводить 3D-реконструкции с изотропным разрешением16.
В настоящем документе представлен пассивный клиринговый подход, позволяющий значительно сократить сроки клиринга, необходимые в соответствии с протоколом CLARITY. Описанная здесь методологическая основа позволяет реконструировать целое сердце мыши с микрометрическим разрешением в одном томографическом сканировании со временем получения порядка минут.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой работе был представлен успешный подход к очистке, окрашиванию и изображению целого сердца мыши в высоком разрешении. Сначала был оптимизирован и выполнен протокол трансформации тканей (CLARITY), слегка модифицированный для его применения на сердечной ткани. Действительно, чтобы по?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект получил финансирование от исследовательской и инновационной программы Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения No 952166 (REPAIR), MUR в рамках программы FISR, проекта FISR2019_00320 и Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, проекта PERCARE.
Materials
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
- Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
- Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
- Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
- Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
- Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative – open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).
- Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).
