Tüm Fare Kalbinin Mezoskopik Optik Görüntülenmesi
Summary
Doku transformasyonu ve boyamadaki yeni gelişmeleri eksenel olarak taranmış bir ışık tabakası mikroskobunun geliştirilmesiyle birleştirerek tüm fare kalbinin mezoskopik rekonstrüksiyonu için bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Hem genetik hem de genetik olmayan kalp hastalıkları kalpte ciddi yeniden şekillenme süreçlerine neden olabilir. Kollajen birikimi (fibrozis) ve hücresel yanlış hizalama gibi yapısal yeniden modelleme, elektriksel iletimi etkileyebilir, elektromekanik işlev bozukluklarına neden olabilir ve sonunda aritmilere yol açabilir. Bu fonksiyonel değişikliklerin mevcut öngörücü modelleri, entegre olmayan ve düşük çözünürlüklü yapısal bilgilere dayanmaktadır. Bu çerçeveyi farklı bir büyüklük sırasına yerleştirmek, standart görüntüleme yöntemlerinin masif dokuda yüksek çözünürlüklü görüntüleme gerçekleştirmedeki etkisizliği nedeniyle zordur. Bu çalışmada, tüm fare kalplerinin mikrometrik çözünürlükle görüntülenmesini sağlayan metodolojik bir çerçeve tanımladık. Bu hedefe ulaşmak, doku transformasyonu ve görüntüleme yöntemlerindeki gelişmelerin birleştirildiği teknolojik bir çaba gerektirmiştir. İlk olarak, sağlam bir kalbi yüksek şeffaflık ve derin lekelenmeye izin veren nanogözenekli, hidrojel hibridize, lipit içermeyen bir forma dönüştürebilen optimize edilmiş bir CLARITY protokolünü açıklıyoruz. Daha sonra, mikron ölçeğinde çözünürlükte mezoskopik bir görüş alanının (mm ölçeğinde) görüntülerini hızlı bir şekilde elde edebilen bir floresan ışık tabakası mikroskobu açıklanmaktadır. MezoSPIM projesini takiben, tasarlanan mikroskop, tek bir tomografik taramada tüm fare kalbinin mikrometrik çözünürlükle yeniden yapılandırılmasına izin verir. Bu metodolojik çerçevenin, sitomimari kargaşanın elektriksel işlev bozukluklarına katılımının açıklığa kavuşturulmasına izin vereceğine ve hem işlevsel hem de yapısal verileri dikkate alan kapsamlı bir modelin önünü açacağına, böylece doku yeniden şekillenmesinden sonra elektriksel ve mekanik değişikliklere yol açan yapısal nedenlerin birleşik bir şekilde araştırılmasını sağlayacağına inanıyoruz.
Introduction
Kalp hastalıkları ile ilişkili yapısal yeniden yapılanma elektrik iletimini etkileyebilir ve organın elektromekanik işlev bozukluklarına neden olabilir 1,2. Fonksiyonel değişiklikleri tahmin etmek için kullanılan güncel yaklaşımlar, fibroz birikiminin, vasküler ağacın ve kalbin lif dağılımının genel bir rekonstrüksiyonunu elde etmek için MRG ve DT-MRG’yi yaygın olarak kullanır ve organ boyunca tercihli eylem potansiyeli yayılım (APP) yollarını modellemek için kullanılır 3,4. Bu stratejiler kalp organizasyonuna güzel bir genel bakış sağlayabilir. Bununla birlikte, uzamsal çözünürlükleri, yapısal yeniden yapılanmanın hücresel düzeyde kardiyak fonksiyon üzerindeki etkisini araştırmak için yetersizdir.
Bu çerçeveyi, tek hücrelerin eylem potansiyeli yayılımı üzerinde bireysel roller oynayabileceği farklı bir büyüklük sırasına yerleştirmek zordur. Temel sınırlama, masif (santimetre boyutlu) dokularda yüksek çözünürlüklü görüntüleme (mikrometrik çözünürlük) gerçekleştirmek için standart görüntüleme yöntemlerinin verimsizliğidir. Aslında, biyolojik dokuları 3D olarak yüksek çözünürlükte görüntülemek, doku opaklığı nedeniyle çok karmaşıktır. Tüm organlarda 3D rekonstrüksiyonları gerçekleştirmek için en yaygın yaklaşım, ince kesitler hazırlamaktır. Bununla birlikte, hassas kesitleme, montaj ve görüntüleme önemli çaba ve zaman gerektirir. Numunenin kesilmesini gerektirmeyen alternatif bir yaklaşım, şeffaf bir doku oluşturmaktır. Son yıllarda, dokuları berraklaştırmak için çeşitli metodolojiler önerilmiştir 5,6,7,8. Masif, şeffaf ve floresan olarak etiketlenmiş dokular üretme zorluğu, son zamanlarda gerçek doku dönüşüm yaklaşımları geliştirilerek elde edilmiştir (CLARITY9, SHIELD10). Özellikle, CLARITY yöntemi, bozulmamış bir dokunun, membran lipit çift katmanlarının seçici olarak çıkarılmasıyla yüksek şeffaflık kazandırmayı sağlayan nanogözenekli, hidrojel-hibridize, lipit içermeyen bir forma dönüştürülmesine dayanır. Özellikle, bu yöntem kardiyak preparatta da başarılı bulunmuştur11,12,13,14. Bununla birlikte, kalp aktif bir temizlik için uygun olamayacak kadar kırılgan olduğundan, tam şeffaflık sağlamak için uzun zaman gerektiren pasif yaklaşım kullanılarak temizlenmelidir.
Işık tabakası mikroskobu gibi gelişmiş görüntüleme teknikleriyle birlikte, CLARITY 3D masif kalp dokularını mikrometrik çözünürlükte görüntüleme potansiyeline sahiptir. Işık tabakası mikroskobunda, numunenin aydınlatılması, algılama hedefinin odak düzleminde sınırlı ince bir ışık tabakası ile gerçekleştirilir. Floresan emisyonu, aydınlatma düzlemi15’e dik bir eksen boyunca toplanır. Algılama mimarisi geniş alan mikroskobuna benzer ve bu da edinimi lazer tarama mikroskoplarından çok daha hızlı hale getirir. Numunenin ışık tabakası boyunca hareket ettirilmesi, santimetre büyüklüğündeki numunelere kadar büyük örneklerin tam bir tomografisinin elde edilmesini sağlar. Bununla birlikte, Gauss ışınının içsel özellikleri nedeniyle, yalnızca sınırlı bir uzamsal uzantı için çok ince (birkaç mikron mertebesinde) bir ışık tabakası elde etmek mümkündür, böylece görüş alanını (FoV) büyük ölçüde sınırlar. Son zamanlarda, bu sınırlamanın üstesinden gelmek için yeni bir uyarma şeması tanıtıldı ve beyin görüntüleme için uygulandı ve izotropik çözünürlük16 ile 3d rekonstrüksiyonlara izin verdi.
Bu yazıda, CLARITY protokolünün ihtiyaç duyduğu takas zamanlamasının önemli ölçüde azaltılmasını sağlayan pasif bir takas yaklaşımı sunulmuştur. Burada açıklanan metodolojik çerçeve, tüm fare kalbinin mikrometrik çözünürlükle tek bir tomografik taramada dakika sırasına göre bir edinme süresiyle yeniden yapılandırılmasına izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, bütün bir fare kalbini yüksek çözünürlükte temizlemek, lekelemek ve görüntülemek için başarılı bir yaklaşım tanıtıldı. İlk olarak, bir doku dönüşüm protokolü (CLARITY) optimize edildi ve uygulandı, kalp dokusuna uygulanması için biraz modifiye edildi. Gerçekten de, bütün bir kalbin 3B’sinde etkili bir rekonstrüksiyon elde etmek için, ışık saçılması fenomenini önlemek esastır. CLARITY metodolojisi, oldukça şeffaf ve sağlam bir kalp elde etmemizi sağlar, ancak …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje, Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programından 952166 No’lu hibe anlaşması (REPAIR), FISR programı kapsamında MUR, proje FISR2019_00320 ve Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE projesi kapsamında fon almıştır.
Materials
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
- Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
- Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
- Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
- Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
- Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative – open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).
- Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).
