Method Article

G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)를 통합 한 모델 지질 막의 건설

DOI:

10.3791/62830

⸱

February 5th, 2022

 ,  , 
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 항리고적으로 중요한 G 단백질 결합 수용체의 종류 중 하나인 인간 1A 세로토닌 수용체 단백질(5-HT1AR)의 재구성을 위해 여기에 설명된 바와 같이, 일체형 막 단백질(IMP)을 거대한 유니라멜라 지질 소포(GUV)에 통합하기 위한 강력하고 일반화가능한 기술로 아가로즈 팽윤을 활용한다.

Abstract

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일체막 단백질의 구조와 기능에 대한 견고한 체외 조사는 플라즈마 멤브레인의 복잡성과 살아있는 세포에서 단백질 거동에 영향을 미치는 수많은 요인으로 인해 어려움을 받고 있습니다. 거대한 unilamellar 소포 (GUV)는 단백질 막 상호 작용을 조사하고 정확하고 자극의존적인 방식으로 단백질 행동을 조사하기위한 생체 모방 및 고도의 튜닝 시험 관 모델 시스템입니다. 이 프로토콜에서, 우리는 인간 세로토닌 1A 수용체 (5-HT1AR)로 GUV를 제조하기위한 저렴하고 효과적인 방법을 제시(5-HT1AR) 안정적으로 멤브레인에 통합. 변형된 하이드로겔 부종 방법을 사용하여 GUV를 제조합니다. 아가로즈와 5-HT1AR의 혼합물 위에 지질 필름을 증착한 다음 전체 시스템을 수분을 공급함으로써, 소포는 멤브레인에 통합된 적절히 지향적이고 기능적인 5-HT1AR으로 형성될 수 있다. 이 GUV는 그 때 현미경 검사를 통해 단백질 막 상호 작용 및 현지화 행동을 검토하기 위하여 이용될 수 있습니다. 궁극적으로, 이 프로토콜은 일체형 막 단백질의 기능에 대한 이해를 발전시켜 심오한 생리적 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Introduction

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합성 모형 멤브레인은 생물막의 근본적인 특성 및 기능에 대한 조사에서 강력한 도구입니다. 거대한 unilamellar 소포 (GUV)는 다양한 플라즈마 막 특성을 연구하는 가장 눈에 띄는 플랫폼 중 하나이며 다른 생리 적 조건을 모방하도록 설계 될 수있다1,2,3,4,5,6,7,8. 플라즈마 멤브레인과 그 조직이 신호 트랜스듀션, 접착, 내분비증 및 수송9,10,11,12,13,14,15와 같은 수많은 세포 공정에서 중요한 역할을 한다는 것이 잘 확립되어 있습니다.

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Protocol

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1. 단백질 라벨링

  1. NHS-로다민, 5-HT1A 멤브레인 파편, 그리고 17 K MWCO 스핀 탈염 컬럼을 실내 온도에서 평형화 할 수 있습니다.
  2. 디메틸 설산화물(DMSO)의 100 μL에서 NHS 로다민 1 mg을 녹입니다.
  3. 5μL의 1M 나트륨 중탄산염 용액을 추가하여 5-HT1AR 용액의 pH를 pH 8로 증가시면 됩니다.
  4. NHS-로다민 용액의 3.66 μL을 5-HT1AR 용액의 50 μL에 추가하고 마이크로 센티슈에이체 튜브에서 파이펫을 부드럽게 위아래로 넣습니다.
    참고: NHS-로다민을 10배 이상 초과하는 경우를 확인하십시오.
  5. 혼합물을 빛으로부터 보호하고 실온에서 회전기위에 1시간 동안 착용하십시오.
  6. 7k MWCO 스핀 컬럼을 1x 인산완충식식염수(1x PBS)의 200μL로 세척하여 1.5RCF에서 1.5분 동안 3회 세척할 수 있습니다.
  7. 표지된 단백질을 한 컬럼에 추가하고 다른 미세원심분리기 튜브의 양을 균형이 조정합니다.
  8. 1.5 RCF에서 5 분 동안 라벨이 부착 된 단백질을 한 번 회전하십시오.
  9. 280nm 및 554 nm의 나노 드롭 분광계를 사용하여....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단백질의 농도를 측정하였고, 라벨링 정도는 염료와 단백질 사이의 어금니 비로 1:1로 계산되었다. 공초점 현미경 검사를 사용하여 GUV를 검사함으로써 소포의 성공적인 형성 및 단백질 통합을 확인할 수 있었습니다. 지질은 0.4 mol% ATTO 488-DPPE로 표지되었고, 단백질은 1차 아민의 로다민 NHS-에스테르 변형을 통해 공유로 표지되었다. 도 2a 및 도 2b 는 각각 ATTO 488 및 로다민 채널에서 단백질 통합 소포를 보여준다. 모든 현미경 사진은 어두운 전류와 평면 고쳐졌습니다. 도 2c 및 도 2d 는 단백질이 통합되지 않은 음성 대조군 GUV를 나타내고 있다. 도 3a 및 도 3b 는 두 채.......

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Discussion

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플라즈마 처리와 지질 증착이라는 전체 프로토콜의 성공에 중요한 두 가지 단계를 확인했습니다. 플라즈마 청소는 두 가지를 달성 : 첫째, 유리 표면에서 유기 물질의 흔적을 제거; 둘째, 커버슬립 표면을 활성화하여 유리 표면 친수성이 증가함에 따라 웨이트성이 증가하여 62,63. 커버슬립 표면 후 플라즈마 세척을 만지면 초클린 표면이 비활성화되고 오염되는 것을 강력히 권장합니다. 우리의 추천은 아가로즈 슬립 주조 단계에 대한 커버립을 처리 할 때 커버 슬립의 가장자리와 밑면을 만터치하는 것입니다. 이 방법은 가스 크로마토그래피(GC) 바늘과 공기 스트림이 한 번에 몇 마이크로리터의 지질 용액을 증착해야 하는 드롭와이즈 지질 증착을 사용하여 하이드로겔 표면에 지질 필름의 양을 정밀하게 제어할 수 있도록 합니다. 이 방법의 단점은 신중하게 수행하지 않으면 두꺼운 지질 필름을 가진 몇 가지 선택 영역이 발생할 수 있으므로 GUV 수율.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 귀중한 토론과 조언을 매튜 블로셔에게 감사드립니다. 이 작품은 해군 연구실 (N00014-16-16-1-2382)과 국립 과학 재단 (PHY-1915017)에 의해 지원되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Avanti 극지방질, 알라바스터, AL850375C-25mg
  TI-Eclipse 도립 현미경Nikon, Melville, NYEclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL850355C-25mg
13/16″ ID, 1&프라임; OD 실리콘 O-링스털링 씰 & 공급, 넵튠, IN5-003-8770
16비트 캐스케이드 II 512 전자 곱셈 전하 결합 장치 카메라광도측정, 헌팅턴 비치, 캘리포니아  Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL850457C-25mg
50 mW 고체 상태 레이저 488 nm 및 525 nm를 중심으로하는 방출 필터 및 561 nm를 중심으로하는 방출 필터 595 nmCoherent, Santa Clara, CA488 / 561-50-LS
5-HT1AR 멤브레인 조각Perkin Elmer, Waltham, MARBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)ATTO-TEC, Siegen, GermanyAD 488-155
벤치 탑 플라즈마 세척기Harrick Plasma, Ithaca, NYPDC-32G
소 혈청 알부민 (BSA)Sigma Aldrich, St. Louis, MOA9418
클로로포름 (CHCl3)Millipore Sigma, Burlington, MACX1055
콜레스테롤 (Chol)Sigma Aldrich, St. Louis, MOC8667-5G
Corning 96-well Flat Clear BottomCorning, Corning, NY3904
Elmasonic E-Series E15H UltrasonicElma, Singen, Germany[no longer sold on main website]
glucoseSigma Aldrich, St. Louis, MOG7528
메탄올 (MeOH)Millipore Sigma, Burlington, MAMX0485
NanoDrop ND-1000Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAND-1000
NHS-RhodamineThermo Fisher Scientific, Waltham, MA46406
인산염 완충 식염수(PBS) (10x PBS)Corning, Corning, NY21-040
스피닝 디스크 CSUX 컨포칼 헤드Yokogawa,Tokyo, JapanCSU-X1
표준 25mm no. 1 유리 커버 슬립ChemGlass, Vineland, NJCLS-1760
자당Sigma Aldrich, St. Louis, MOS7903
Sykes-Moore 챔버Bellco, Vineland, NJ1943-11111
초저 용융 온도 아가로 오스Sigma Aldrich, St. Louis, MOA5030
VWR 아날로그 히트 블록VWR International, Radnor, PA[더 이상 메인 웹사이트에서 판매되지 않음]
VWR Tube RotatorVWR International, Radnor, PA10136-084
Zeba 스핀 탈염 컬럼, 7K MWCO, 0.5mLThermo Fisher Scientific, Waltham, MA89882

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
  2. Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane q....

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Model Lipid MembranesG Protein Coupled ReceptorsGiant Unilamellar VesiclesIntegral Membrane ProteinsProtein Membrane InteractionsHydrogel SwellingMembrane Protein Incorporation5 HT1A ReceptorBiomimetic MembranesProtein Localization

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