Construcción de membranas lipídicas modelo que incorporan receptores acoplados a proteínas G (GPCR)

Summary

Este protocolo utiliza la hinchazón de agarosa como una técnica poderosa y generalizable para incorporar proteínas de membrana integral (IMP) en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (GUV), como se describe aquí para la reconstitución de la proteína receptora de serotonina 1A humana (_5-HT1AR), una de las clases de receptores acoplados a proteínas G farmacológicamente importantes.

Abstract

Las investigaciones robustas in vitro de la estructura y función de las proteínas de membrana integral han sido un desafío debido a las complejidades de la membrana plasmática y los numerosos factores que influyen en el comportamiento de las proteínas en las células vivas. Las vesículas unilamelares gigantes (GUV) son un sistema modelo in vitro biomimético y altamente sintonizable para investigar las interacciones proteína-membrana y sondear el comportamiento de las proteínas de una manera precisa y dependiente del estímulo. En este protocolo, presentamos un método económico y eficaz para fabricar GUVs con el receptor humano de serotonina 1A (_5-HT1AR) integrado de forma estable en la membrana. Fabricamos GUV utilizando un método de hinchazón de hidrogel modificado; al depositar una película lipídica sobre una mezcla de agarosa y _5-HT1AR y luego hidratar todo el sistema, se pueden formar vesículas con _5-HT1AR adecuadamente orientado y funcional incorporado a la membrana. Estos GUV se pueden usar para examinar las interacciones proteína-membrana y el comportamiento de localización a través de microscopía. En última instancia, este protocolo puede avanzar en nuestra comprensión de la funcionalidad de las proteínas de membrana integral, proporcionando una visión fisiológica profunda.

Introduction

Las membranas modelo sintéticas son herramientas poderosas en la investigación de las propiedades y funciones fundamentales de las biomembranas. Las vesículas unilamelares gigantes (GUV) son una de las plataformas más prominentes para estudiar una variedad de propiedades de la membrana plasmática y pueden diseñarse para imitar diferentes condiciones fisiológicas1,2,3,4,5,6,7,8. Está bien establecido que la membrana plasmática y su organización juegan un papel clave en multitud de procesos celulares, como la transducción de señales, la adhesión, la endocitosis y el transporte9,10,11,12,13,14,15.

Los GUV se han fabricado utilizando diversos métodos, incluyendo hidratación ^suave16, hinchazón de ^hidrogel17, ^{electroformación18}, técnicas microfluídicas19,20,21,22, ^chorro23 e intercambio de ^{disolventes24,25,26}. Debido a los desafíos en el manejo de proteínas integrales de membrana (IMP), las plataformas in vitro para estudiarlas han sido limitadas. Los GUV presentan una plataforma simplificada para estudiar IMP en un entorno que imita su entorno nativo. Aunque han existido varios enfoques para la reconstitución de proteínas en los GUV, surgen desafíos al incorporar proteínas con la orientación correcta y mantener la funcionalidad de las ^proteínas27.

La reconstitución de proteínas más exitosa en los GUV requiere el método de intercambio de detergente; lo que implica la solubilización de las proteínas de su entorno nativo mediante detergentes, seguido de la purificación de proteínas, y luego la sustitución de las moléculas de detergente por lípidos a través de diversos ^métodos28. Mientras que los detergentes sirven para estabilizar la estructura terciaria de los IMP durante la purificación, las micelas detergentes son un ambiente relativamente antinatural para estas proteínas, que se estabilizan mejor, particularmente para estudios funcionales, en bicapas lipídicas28,29,30. Además, la incorporación de proteínas transmembrana funcionales en la bicapa lipídica utilizando técnicas tradicionales de fabricación de GUV ha sido difícil debido al tamaño, la delicadeza de estas proteínas y los pasos adicionales de intercambio de detergente que se necesitarían27,31,32,33. El uso de disolvente orgánico para eliminar detergentes provoca la agregación y desnaturalización de ^proteínas34. Un método mejorado mediado por detergente ha sido prometedor, sin embargo, se necesita precaución para el paso de eliminación de detergente y la optimización podría ser necesaria para proteínas ^{específicas31,35}. Además, los métodos que utilizan electroformación podrían restringir la elección de la proteína y pueden no ser adecuados para todas las composiciones lipídicas, especialmente los lípidos cargados31,36,37. Otra técnica que se ha utilizado es la fusión inducida por péptidos de grandes vesículas unilamelares (LUV) que contienen la proteína deseada con GUVs, aunque se encontró que es laboriosa y puede conducir a la inserción de moléculas extrañas: los péptidos fusogénicos33,38,39. Las vesículas gigantes de membrana plasmática (GPPV), que se derivan de células vivas, se pueden utilizar para superar algunos de estos problemas, sin embargo, permiten un control mínimo de la composición lipídica y proteica resultante14,40,41. Por lo tanto, la integración de IMPs en la capa bilipída de GUVs utilizando nuestro método de hinchazón de agarosa modificada presenta un método confiable para examinar más a fondo estas proteínas en el entorno de membrana42,43,44,45.

La señalización y comunicación celular involucra una familia de proteínas conocidas como receptores acoplados a proteínas G (GPCR); Los GPCR se encuentran entre la mayor familia de proteínas y se asocian con la modulación del estado de ánimo, el apetito, la presión arterial, la función cardiovascular, la respiración y el sueño, entre muchas otras funciones ^{fisiológicas46}. En este estudio, utilizamos el receptor humano de serotonina 1A (_5-HT1AR) que es un miembro prototípico de la familia GPCR. _5-HT1AR se puede encontrar en el sistema nervioso central (SNC) y los vasos sanguíneos; influye en numerosas funciones como las cardiovasculares, gastrointestinales, endocrinas, además de participar en la regulación del estado de ^ánimo47. Una gran barrera para la investigación de GPCR surge de su compleja estructura anfifílica, y los GUV presentan una plataforma prometedora para la investigación de diversas propiedades de interés, que van desde la funcionalidad de la proteína, las interacciones lípido-proteína y las interacciones proteína-proteína. Se han utilizado diversos enfoques para estudiar las interacciones lípido-proteína como la resonancia de plasmón de superficie (SPR)^48,49, la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN)^50,51, el ensayo de superposición de lípidos proteicos (PLO)51,52,53,54, la espectrometría de masas ^nativa55, la calorimetría de titulación isotérmica (ITC)^56,57 y el liposoma ensayo de ^{sedimentación58,59}. Nuestro laboratorio ha utilizado el enfoque SIMPLIFICADO de GUV para investigar el efecto de las interacciones lípido-proteína en la funcionalidad de la proteína mediante la incapsulación de BODIPY-GTPγS, que se une con la subunidad _Giα en el estado activo del receptor. Su unión desengancha el fluoróforo produciendo una señal de fluorescencia que podría detectarse con el ^tiempo45. Además, varios estudios investigaron las interacciones lípido-proteína y el papel de las proteínas en la detección o estabilización de la curvatura de la ^{membrana60,61}, y la utilización de un enfoque FACTIBLE de GUV podría ser una ventaja clave.

Este protocolo demuestra un método sencillo para incorporar GPCR en la membrana de los GUV utilizando un sistema de hidrogel de agarosa ^{modificado17,42}. Además, sobre la base de nuestro trabajo anterior, nuestro método podría ser adecuado para imprentas que pueden soportar una exposición a corto plazo a 30-40 °C. Brevemente, extendemos una fina película de agarosa combinada con fragmentos de membrana que contienen el GPCR de interés. Después de la gelificación de esta capa, depositamos una solución lipídica sobre la agarosa y permitimos que el disolvente se evapore. La rehidratación del sistema se realizó entonces con un tampón acuoso, dando como resultado la formación de GUVs con proteína incorporada en la bicapa lipídica.

Protocol

1. Etiquetado de proteínas Permita que NHS-Rhodamine, fragmentos de membrana 5-HT1A y una columna de desalinización de espín de 7 K MWCO se equilibren a temperatura ambiente. Disolver 1 mg de NHS-rhodamine en 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO). Agregue 5 μL de solución de bicarbonato de sodio 1 M para aumentar el pH de la solución de 5-HT1AR a pH 8. Añadir 3,66 μL de la solución de NHS-rodamina a 50 μL de la solución de 5-HT1AR y pipetea…

Representative Results

Se midió la concentración de proteína y se calculó el grado de etiquetado como la relación molar entre el colorante y la proteína para ser 1:1. Al examinar los GUV utilizando microscopía confocal, pudimos confirmar la formación exitosa y la integración de proteínas de las vesículas. Los lípidos se marcaron con 0,4 mol% ATTO 488-DPPE, y la proteína se marcó covalentemente a través de la modificación del éster NHS de rodamina de las aminas primarias. La Figura 2a y <strong cla…

Discussion

Hemos identificado dos pasos que son críticos para el éxito del protocolo general: el tratamiento con plasma y la deposición de lípidos. La limpieza con plasma de las cubiertas es esencial para garantizar que haya una cobertura y adhesión adecuadas del hidrogel de agarosa a la cubierta de vidrio. La limpieza por plasma logra dos cosas: primero, elimina rastros de materia orgánica de la superficie del vidrio; en segundo lugar, activa la superficie de la cubierta, lo que permite un aumento de la humectabilidad a medi…

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850375C-25mg
TI-Eclipse inverted microscope	Nikon, Melville, NY	Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings	Sterling Seal & Supply, Neptune, IN	5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera	Photometrics, Huntington Beach, CA	Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm	Coherent, Santa Clara, CA	488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments	Perkin Elmer, Waltham, MA	RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)	ATTO-TEC, Siegen, Germany	AD 488-155
Bench top plasma cleaner	Harrick Plasma, Ithaca, NY	PDC-32G
bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A9418
chloroform (CHCl3)	Millipore Sigma, Burlington, MA	CX1055
Cholesterol (Chol)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom	Corning, Corning, NY	3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic	Elma, Singen, Germany	[no longer sold on main website]
glucose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	G7528
methanol (MeOH)	Millipore Sigma, Burlington, MA	MX0485
NanoDrop ND-1000	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	ND-1000
NHS-Rhodamine	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS)	Corning, Corning, NY	21-040
spinning-disc CSUX confocal head	Yokogawa,Tokyo, Japan	CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips	ChemGlass, Vineland, NJ	CLS-1760
sucrose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	S7903
Sykes-Moore chambers	Bellco, Vineland, NJ	1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A5030
VWR Analog Heatblock	VWR International, Radnor, PA	[no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator	VWR International, Radnor, PA	10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	89882