लाओडेल्फैक्स स्ट्राटेलस लार संग्रह के लिए दो स्तरित झिल्ली सैंडविच विधि
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल कृत्रिम माध्यम का उपयोग करके भेदी-चूसने वाली कीड़ों से पर्याप्त लार एकत्र करने की विधि का वर्णन करता है। यह कीट लार इकट्ठा करने और कीट खिला व्यवहार और वेक्टर जनित वायरस संचरण पर लार समारोह का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका है।
Abstract
चावल धारी वायरस (आरएसवी), जो पूर्वी एशिया में कृषि के महत्वपूर्ण आर्थिक नुकसान का कारण बनता है, पूरी तरह से मेजबान चावल के बीच अपने प्रभावी संचरण के लिए कीट वैक्टर पर निर्भर करता है । लाओडेल्फैक्स स्ट्राटेलस (छोटे भूरे रंग के प्लांटहॉपर, एसबीपीएच) प्राथमिक कीट वेक्टर है जो क्षैतिज रूप से आरएसवी को पहुंचाता है जबकि फ्लोएम से रस चूसने के दौरान। लार कीड़ों के खिलाने के व्यवहार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एक सुविधाजनक विधि जो भेदी-चूसने वाले भोजन व्यवहार के साथ कीड़ों की लार पर शोध के लिए उपयोगी होगी, यहां वर्णित है। इस विधि में, कीड़ों को दो फैला पैराफिन फिल्म परतों के बीच सैंडविच किए गए कृत्रिम आहार पर खिलाने की अनुमति दी गई थी। लार युक्त आहार प्रत्येक दिन एकत्र किया गया था, फ़िल्टर किया गया था, और आगे के विश्लेषण के लिए केंद्रित था। अंत में, एकत्र लार की गुणवत्ता प्रोटीन धुंधला और इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा जांच की गई। एसबीपीएच की लार में आरएसवी की उपस्थिति और म्यूसिन जैसे प्रोटीन का पता लगाकर इस विधि का उदाहरण दिया गया। ये कृत्रिम भोजन और लार संग्रह विधि भोजन व्यवहार और वायरस संचरण से संबंधित कीट लार में कारकों पर आगे अनुसंधान के लिए एक नींव रखेंगे ।
Introduction
टेनुइवायरसजीनस में नकारात्मक रूप से फंसे आरएनए वायरस चावल धारी वायरस (आरएसवी)पूर्वी एशिया1,2,3में चावल उत्पादन में गंभीर बीमारियों का कारण बनता है । संक्रमित चावल के पौधों से स्वस्थ लोगों के लिए आरएसवी का संचरण कीट वैक्टर पर निर्भर करता है, मुख्य रूप से लाओडेल्फैक्स स्ट्राटेलस, जो लगातार प्रचारात्मक तरीके से आरएसवी को पहुंचाता है। एसबीपीएच आरएसवी-संक्रमित पौधों पर भोजन करने के बाद वायरस प्राप्त करता है। एक बार कीट के अंदर, आरएसवी खिलाने के एक दिन बाद मिडगुट एपिथेलियल सेल को संक्रमित करता है और फिर हीमोलिम्फ में प्रवेश करने के लिए मिडगुट बैरियर से गुजरता है। इसके बाद, आरएसवी हीमोलिम्फ के माध्यम से विभिन्न ऊतकों में फैलता है और फिर प्रचारित करता है। अधिग्रहण के बाद लगभग 10-14 दिनों की अव्यक्त अवधि के बाद, लार ग्रंथि के अंदर वायरस को स्रावित लार के माध्यम से स्वस्थ मेजबान पौधों में प्रेषित किया जा सकता है जबकिएसबीपीएच फ्लोएम4,5,6,7,8,9,10 से रस बेकार करता है . कीट से मेजबान पौधे तक आरएसवी के प्रसार के लिए एक कुशल भोजन प्रक्रिया और लार में विभिन्न कारक आवश्यक हैं।
लार ग्रंथियों द्वारा स्रावित कीट लार को कीड़े, वायरस और मेजबान पौधों में मध्यस्थता करने के लिए माना जाता है। हेमीप्टरन कीट आमतौर पर दो प्रकार की लार उत्पन्न करते हैं: लार और पानी की लार11,12,13. गेलिंग लार मुख्य रूप से मेजबान कोशिकाओं के बीच स्टाइल के आंदोलन को बनाए रखने के लिए एपोप्लाज्म में स्रावित होती है और इसका संबंध पौधों के प्रतिरोध और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पर काबू पाने से भी है14,15,16,17. भोजन के जांच चरण में, कीड़े रुक-रुककर जेलिंग लार को स्रावित करते हैं जो तुरंत सतह फ्लैंज बनाने के लिए ऑक्सीकरण हो जाता है। फिर, एकल या शाखादार म्यान एक ट्यूबलर चैनल 18,19,20आरक्षित करने के लिए स्टाइल को संलग्नकरतेहैं। एपिडर्मिस पर सतह फ्लैंज को एक लंगर बिंदु के रूप में सेवा करके स्टाइल के प्रवेश को सुविधाजनक माना जाता है, जबकि स्टाइल के चारों ओर म्यान यांत्रिक स्थिरता और स्नेहन16, 21,22,23प्रदान कर सकता है। एनएलएसएचपी को लार म्यान गठन और भूरे रंग के प्लांटहॉपर(निलापरवता लुगेन्स,बीपीएच) के सफल भोजन के लिए एक आवश्यक प्रोटीन के रूप में पहचाना गया था। एफिड एसिर्थोस्फोन पिसम द्वारा स्रावित संरचनात्मक म्यान प्रोटीन (एसएचपी) की अभिव्यक्ति के अवरोध ने मेजबान छलनीट्यूबों 24से भोजन में बाधा डालकर अपने प्रजनन को कम कर दिया । इसके अलावा, कुछ कीट प्रजातियों में, जेल लार कारकों को तथाकथित शाकाहारी से जुड़े आणविक पैटर्न (HAMPs) बनाकर पौधों की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करने के लिए माना जाता है। एन लुगेन्स,एनएलएमएलपी में, म्यान गठन से संबंधित एक म्यूसिन जैसे प्रोटीन, सेल मृत्यु, रक्षा से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति, और कैलोस बयान 25,26सहित खिलाने के खिलाफ पौधे की सुरक्षा प्रेरित करता है। इसके अलावा, एफिड्स में कुछ जेल लार कारकों को रोगजनक से जुड़े आणविक पैटर्न12, 15, 27के समान जीन-टू-जीन इंटरैक्शन के माध्यम से संयंत्र रक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करने के लिए साबित किया गया है।
कीट आहार और/या रोगजनक संचरण के लिए आवश्यक लार कारकों का अध्ययन करने के लिए, स्रावित लार का विश्लेषण करना आवश्यक है । यहां, लार की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने के लिए कृत्रिम भोजन और संग्रह विधियों को आगे के विश्लेषण के लिए वर्णित किया गया है। केवल एक ही पोषण तत्व युक्त माध्यम का उपयोग करके, कई लार प्रोटीन एकत्र किए गए और चांदी के धुंधला और पश्चिमी दाग द्वारा विश्लेषण किया गया। यह विधि लार में कारकों पर आगे अनुसंधान में सहायक होगी जो एसबीपीएच द्वारा आरएसवी संचरण के लिए आवश्यक हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
कृत्रिम आहार पर कीटों के सफल पालन की सूचना सबसे पहले 1962 में दी गई थी जब मिटलर और देड ने29,30कृत्रिम आहार धारण करने के लिए पैराफिन झिल्ली तकनीक का वर्णन किया था । और इस विधि कीट जीव विज्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (नंबर 32072385) और यूथ इनोवेशन प्रमोशन एसोसिएशन सीएएस (2021084) द्वारा चीन के नेशनल प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (नंबर 2019YFC1200503) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| 10-KD centrifugal filter | Merck Millipore | R5PA83496 | For concentration |
| 10x Protein Transfer Buffer(wet) | macGENE | MP008 | Transfer buffer for western blotting |
| 10x TBST buffer | Coolaber | SL1328-500mL×10 | Wash buffer for western blotting |
| Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Imaging system for western blotting and silver staining |
| Color Prestained protein ladder | GenStar | M221-01 | Protein marker for western blotting |
| ECL western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | Western blotting detection |
| Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit | TIANGEN | #PA110 | Chromogenic reaction |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Sigma | 401393-2ML | Polyclonal secondary antibody for western blotting |
| Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | Transfer membrane for western blotting |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | For quantitative real-time PCR (qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RB | For filtration |
| Mini-PROTEAB TGX Gels | Bio-Rad | 4561043 | For SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Detection of protein concentration |
| Nylon membrane | PALL | T42754 | Membrane for dot-ELISA |
| Parafilm M Membrane | Sigma | P7793-1EA | Making artifical diet sandwichs |
| Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides | Genstript | Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting | |
| Rabbit anti-RSV polyclonal antibody | Genstript | Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA | |
| RNAprep pure Micro Kit | TIANGEN | DP420 | For RNA Extraction |
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