Tweelaagse membraansandwichmethode voor Laodelphax striatellus Speekselcollectie
Summary
Het huidige protocol beschrijft een methode om voldoende speeksel van priemzuigende insecten te verzamelen met behulp van een kunstmatig medium. Dit is een handige methode voor het verzamelen van insectenspeeksel en het bestuderen van speekselfunctie op insectenvoedingsgedrag en vectoroverdraagbare virusoverdracht.
Abstract
Rijststreepvirus (RSV), dat een aanzienlijk economisch verlies van landbouw in Oost-Azië veroorzaakt, is volledig afhankelijk van insectenvectoren voor zijn effectieve overdracht onder gastheerrijst. Laodelphax striatellus (kleine bruine planthopper, SBPH) is de primaire insectenvector die RSV horizontaal doorgeeft terwijl sap uit het floëem wordt gezogen. Speeksel speelt een belangrijke rol in het voedingsgedrag van insecten. Een handige methode die nuttig zal zijn voor onderzoek naar het speeksel van insecten met piercing-zuigend voedingsgedrag wordt hier beschreven. Bij deze methode mochten insecten zich voeden met een kunstmatig dieet ingeklemd tussen twee uitgerekte paraffinefilmlagen. Het dieet met het speeksel werd elke dag verzameld, gefilterd en geconcentreerd voor verdere analyse. Ten slotte werd de kwaliteit van het verzamelde speeksel onderzocht door eiwitkleuring en immunoblotting. Deze methode werd geïllustreerd door de aanwezigheid van RSV en een mucine-achtig eiwit in het speeksel van SBPH te detecteren. Deze kunstmatige voedings- en speekselverzamelingsmethode zal een basis leggen voor verder onderzoek naar factoren in insectenspeeksel gerelateerd aan voedingsgedrag en virusoverdracht.
Introduction
Rijststreepvirus (RSV), een negatief gestrand RNA-virus in het geslacht Tenuivirus, veroorzaakt ernstige ziekten in de rijstproductie in Oost-Azië1,2,3. Overdracht van RSV van geïnfecteerde rijstplanten naar gezonde is afhankelijk van insectenvectoren, voornamelijk Laodelphax striatellus, die RSV op een persistent-propagatieve manier overbrengt. SBPH verwerft het virus na het voeden met RSV-geïnfecteerde planten. Eenmaal in het insect infecteert RSV de midgut-epitheelcel een dag na het voeden en gaat vervolgens door de midgutbarrière om de hemolymfe te penetreren. Vervolgens verspreidt RSV zich via de hemolymfe in verschillende weefsels en plant zich vervolgens voort. Na een latente periode van ongeveer 10-14 dagen na de verwerving kan het virus in de speekselklier via het uitgescheiden speeksel worden overgedragen op de gezonde waardplanten, terwijl SBPH sap uit het floëemzuigt 4,5,6,7,8,9,10 . Een efficiënt voedingsproces en verschillende factoren in het speeksel zijn essentieel voor de verspreiding van RSV van het insect naar de waardplant.
Insectenspeeksel dat wordt uitgescheiden door speekselklieren wordt verondersteld insecten, virussen en waardplanten te bemiddelen. Hemipteran insecten produceren meestal twee soorten speeksel: geleer speeksel en waterig speeksel11,12,13. Geleerspeeksel wordt voornamelijk uitgescheiden in het apoplasma om de beweging van de stylet tussen gastheercellen te ondersteunen en is ook gerelateerd aan het overwinnen van plantresistentie en immuunresponsen14,15,16,17. In het tasterige stadium van het voeden scheiden insecten met tussenpozen geleerspeeksel af dat onmiddellijk wordt geoxideerd om een oppervlakteflens te vormen. Vervolgens omhullen enkele of vertakte omhulsels de stylet om een buisvormig kanaal18,19,20te reserveren. De oppervlakteflens op de opperhuid wordt verondersteld de penetratie van de stylet te vergemakkelijken door als ankerpunt te dienen, terwijl de mantels rond de stylet mechanische stabiliteit en smering kunnen bieden16,21,22,23. Nlshp werd geïdentificeerd als een essentieel eiwit voor speekselschedevorming en succesvolle voeding van bruine planthopper(Nilaparvata lugens, BPH). Remming van de expressie van het structurele schede-eiwit (SHP) dat wordt uitgescheiden door de bladluis Acyrthosiphon pisum verminderde de reproductie door het voeden van gastheerzeefbuizen te verstoren24. Bovendien wordt bij sommige insectensoorten verondersteld dat gelspeekselfactoren immuunresponsen van planten veroorzaken door zogenaamde herbivore-geassocieerde moleculaire patronen (HAMPs) te vormen. In N. lugensinduceert NlMLP, een mucine-achtig eiwit gerelateerd aan schedevorming, de afweer van planten tegen voeding, waaronder celdood, de expressie van verdedigingsgerelateerde genen en callose-afzetting 25,26. Ook is bewezen dat sommige gelspeekselfactoren bij bladluizen afweerreacties van planten veroorzaken via gen-naar-gen interacties vergelijkbaar met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen12,15,27.
Voor het bestuderen van de speekselfactoren die essentieel zijn voor insectenvoeding en / of pathogene overdracht, is het noodzakelijk om uitgescheiden speeksel te analyseren. Hier worden kunstmatige voedings- en verzamelmethoden beschreven om voldoende hoeveelheden speeksel te verkrijgen voor verdere analyse. Met behulp van een medium dat slechts één voedingselement bevatte, werden veel speekseleiwitten verzameld en geanalyseerd door zilverkleuring en western blotting. Deze methode zal nuttig zijn bij verder onderzoek naar factoren in speeksel die essentieel zijn voor RSV-overdracht door SBPH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Succesvolle kweek van insecten op kunstmatige diëten werd voor het eerst gemeld in 1962 toen Mittler en Dadd de Paraffine-membraantechniek beschreven om een kunstmatig dieet te houden29,30. En deze methode is onderzocht in vele aspecten van insectenbiologie en -gedrag, bijvoorbeeld voedingssupplement, dsRNA-voeding en virusacquisitie. Op basis van de vereisten van speekselanalyse wordt 5% sucrose gebruikt als het algemene kunstmatige dieet om speeksel van SBPH i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het National Key Research and Development Program of China (nr. 2019YFC1200503), door de National Science Foundation of China (nr. 32072385) en door Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084).
Materials
| 10-KD centrifugal filter | Merck Millipore | R5PA83496 | For concentration |
| 10x Protein Transfer Buffer(wet) | macGENE | MP008 | Transfer buffer for western blotting |
| 10x TBST buffer | Coolaber | SL1328-500mL×10 | Wash buffer for western blotting |
| Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Imaging system for western blotting and silver staining |
| Color Prestained protein ladder | GenStar | M221-01 | Protein marker for western blotting |
| ECL western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | Western blotting detection |
| Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit | TIANGEN | #PA110 | Chromogenic reaction |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Sigma | 401393-2ML | Polyclonal secondary antibody for western blotting |
| Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | Transfer membrane for western blotting |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | For quantitative real-time PCR (qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RB | For filtration |
| Mini-PROTEAB TGX Gels | Bio-Rad | 4561043 | For SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Detection of protein concentration |
| Nylon membrane | PALL | T42754 | Membrane for dot-ELISA |
| Parafilm M Membrane | Sigma | P7793-1EA | Making artifical diet sandwichs |
| Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides | Genstript | Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting | |
| Rabbit anti-RSV polyclonal antibody | Genstript | Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA | |
| RNAprep pure Micro Kit | TIANGEN | DP420 | For RNA Extraction |
References
- Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
- Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Virus. The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).
- He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. Evolution of rice stripe virus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).
- Wu, W., et al. Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects. PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).
- Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).
- Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence. Scientific Reports. 6, 38082 (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Huo, Y., et al. Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus. Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Huo, Y., et al. Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).
- Bao, Y. Y., et al. De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response. Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).
- Elzinga, D. A., Jander, G. The role of protein effectors in plant-aphid interactions. Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).
- Bos, J. I., et al. A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid). PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).
- Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach. Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).
- Cao, T. T., Lü, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion. Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).
- De Vos, M., Jander, G. Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell & Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).
- Wang, L., et al. Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera. Scientific Reports. 6, 36254 (2016).
- Wang, Y., et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths. Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).
- Wang, W., et al. Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).
- Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).
- Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).
- Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. Clock genes show circadian rhythms in salivary glands. Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).
- Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).
- Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation. Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).
- Shangguan, X., et al. A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants. Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).
- Petrova, A., Smith, C. M. Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa. Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).
- Zhu, J., et al. Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus. GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).
- Van Bel, A. J., Will, T. Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids. Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).
- Perez-Vilar, J., Hill, R. L. The structure and assembly of secreted mucins. The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).
- Pitino, M., Hogenhout, S. A. Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).
- Zhang, F., Zhu, L., He, G. Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice. Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).
- Hogenhout, S. A., Ammar, E. -. D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects. Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).
