اثنين من الطبقات طريقة ساندويتش الغشاء لمجموعة اللعاب Laodelphax striatellus
Summary
يصف البروتوكول الحالي طريقة لجمع ما يكفي من اللعاب من الحشرات المصة للثقب باستخدام وسيلة اصطناعية. هذه طريقة مريحة لجمع لعاب الحشرات ودراسة وظيفة اللعاب على سلوك تغذية الحشرات وانتقال الفيروس المنقول بالنواقل.
Abstract
ويعتمد فيروس الأرز الشريطي، الذي يسبب خسارة اقتصادية كبيرة للزراعة في شرق آسيا، اعتمادا كليا على ناقلات الحشرات لانتقاله الفعال بين الأرز المضيف. Laodelphax striatellus (زارع البني الصغير ، SBPH) هو ناقل الحشرات الرئيسي الذي ينقل أفقيا RSV أثناء امتصاص النسغ من phloem. يلعب اللعاب دورا مهما في سلوك تغذية الحشرات. يتم وصف طريقة مريحة من شأنها أن تكون مفيدة للبحث في لعاب الحشرات مع سلوك التغذية الثاقبة المص هنا. في هذه الطريقة ، سمح للحشرات بالتغذية على نظام غذائي اصطناعي يقع بين طبقتين من طبقات أفلام البارافين الممتدة. تم جمع النظام الغذائي الذي يحتوي على اللعاب كل يوم ، وتصفيته ، وتركيزه لمزيد من التحليل. وأخيرا، تم فحص نوعية اللعاب التي تم جمعها عن طريق تلطيخ البروتين والمناعة. وقد تجسدت هذه الطريقة من خلال الكشف عن وجود RSV وبروتين يشبه الموسين في لعاب SBPH. وستضع طريقة التغذية الاصطناعية وجمع اللعاب هذه أساسا لإجراء مزيد من البحوث حول العوامل في لعاب الحشرات المتعلقة بسلوك التغذية وانتقال الفيروس.
Introduction
فيروس شريط الأرز (RSV), فيروس الحمض النووي الريبي السلبية الذين تقطعت بهم السبل في جنس تينويvirus, يسبب أمراضا خطيرة في إنتاج الأرز في شرق آسيا1,2,3. ويعتمد انتقال فيروس RSV من نباتات الأرز المصابة إلى النباتات السليمة على ناقلات الحشرات، ولا سيما لاودلفاكس سترياتيلوس، التي تنقل RSV بطريقة مستمرة الانتشار. SBPH يكتسب الفيروس بعد التغذية على النباتات المصابة RSV. بمجرد دخول الحشرة ، تصيب RSV الخلية الظهارية الوسطى بعد يوم واحد من التغذية ثم تمر عبر حاجز منتصف الطريق لاختراق الهيموليم. في وقت لاحق، ينتشر RSV إلى أنسجة مختلفة عن طريق الهيموليم ثم ينتشر. بعد فترة كامنة من حوالي 10-14 يوما بعد الاستحواذ ، يمكن أن ينتقل الفيروس داخل الغدة اللعابية إلى النباتات المضيفة الصحية عن طريق اللعاب المفرز بينما تمتص SBPH النسغ من phloem4و5و6و7و8و9و10 . عملية التغذية الفعالة والعوامل المختلفة في اللعاب ضرورية لانتشار RSV من الحشرة إلى النبات المضيف.
ويعتقد أن لعاب الحشرات التي تفرزها الغدد اللعابية يتوسط الحشرات والفيروسات والنباتات المضيفة. عادة ما تنتج الحشرات الهميبتران نوعين من اللعاب: اللعاب الهلامي واللعاب المائي11،12،13. يفرز اللعاب Gelling أساسا في أبولازم للحفاظ على حركة الأناقة بين الخلايا المضيفة ويرتبط أيضا بالتغلب على مقاومة النبات والاستجابات المناعية14و15و16و17. في مرحلة التحقيق في التغذية ، تفرز الحشرات بشكل متقطع اللعاب الهلامي الذي يتأكسد على الفور لتشكيل شفة سطحية. ثم، أغماد واحدة أو متفرعة تغلف stylet لحجز قناة أنبوبي18،19،20. ويفترض أن شفة السطح على البشرة لتسهيل اختراق stylet من خلال العمل كنقطة مرساة، في حين أن الأغماد حول stylet قد توفر الاستقرار الميكانيكي والتشحيم16،21،22،23. تم تحديد Nlshp كبروتين أساسي لتشكيل غمد اللعاب والتغذية الناجحة للزارع البني(Nilaparvata lugens، BPH). تثبيط التعبير عن بروتين الغمد الهيكلي (SHP) الذي يفرزه pisum Acyrthosiphon المن قلل من تكاثره عن طريق تعطيل التغذية من أنابيب الغربالالمضيفة 24. وعلاوة على ذلك ، في بعض أنواع الحشرات ، من المفترض أن تؤدي عوامل اللعاب الهلامية إلى استجابات مناعية نباتية من خلال تشكيل ما يسمى بالأنماط الجزيئية المرتبطة بالحيوانات العاشبة (HAMPs). في N. lugens, NlMLP, بروتين يشبه الموسين المتعلقة بتشكيل غمد, يحفز الدفاعات النباتية ضد التغذية, بما في ذلك موت الخلية, التعبير عن الجينات المتعلقة بالدفاع, وترسب الشنق 25,26. أيضا ، وقد ثبت أن بعض عوامل اللعاب هلام في المن لتحريك استجابات الدفاع النباتية عن طريق التفاعلات بين الجينات إلى الجينات مماثلة للأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض12،15،27.
لدراسة عوامل اللعاب الأساسية لتغذية الحشرات و / أو انتقال مسببات الأمراض ، من الضروري تحليل اللعاب المفرز. هنا، يتم وصف طرق التغذية الاصطناعية وجمع للحصول على كميات كافية من اللعاب لمزيد من التحليل. باستخدام وسيط يحتوي على عنصر غذائي واحد فقط ، تم جمع العديد من بروتينات اللعاب وتحليلها عن طريق تلطيخ الفضة والنشاف الغربي. هذه الطريقة سوف تكون مفيدة في إجراء مزيد من البحوث على العوامل في اللعاب التي تعتبر ضرورية لانتقال RSV بواسطة SBPH.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم الإبلاغ عن نجاح تربية الحشرات على الوجبات الغذائية الاصطناعية لأول مرة في عام 1962 عندما وصف ميتلر وداد تقنية غشاء البارافين لعقد نظام غذائي اصطناعي29،30. وقد تم استكشاف هذه الطريقة في العديد من جوانب بيولوجيا الحشرات وسلوكها ، على سبيل المثال ، الملحق الغذ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل البرنامج الوطني الصيني للبحوث والتطوير (رقم 2019YFC1200503)، والمؤسسة الوطنية الصينية للعلوم (رقم 32072385)، وجمعية تشجيع الابتكار الشبابي CAS (2021084).
Materials
| 10-KD centrifugal filter | Merck Millipore | R5PA83496 | For concentration |
| 10x Protein Transfer Buffer(wet) | macGENE | MP008 | Transfer buffer for western blotting |
| 10x TBST buffer | Coolaber | SL1328-500mL×10 | Wash buffer for western blotting |
| Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Imaging system for western blotting and silver staining |
| Color Prestained protein ladder | GenStar | M221-01 | Protein marker for western blotting |
| ECL western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | Western blotting detection |
| Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit | TIANGEN | #PA110 | Chromogenic reaction |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Sigma | 401393-2ML | Polyclonal secondary antibody for western blotting |
| Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | Transfer membrane for western blotting |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | For quantitative real-time PCR (qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RB | For filtration |
| Mini-PROTEAB TGX Gels | Bio-Rad | 4561043 | For SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Detection of protein concentration |
| Nylon membrane | PALL | T42754 | Membrane for dot-ELISA |
| Parafilm M Membrane | Sigma | P7793-1EA | Making artifical diet sandwichs |
| Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides | Genstript | Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting | |
| Rabbit anti-RSV polyclonal antibody | Genstript | Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA | |
| RNAprep pure Micro Kit | TIANGEN | DP420 | For RNA Extraction |
References
- Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
- Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Virus. The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).
- He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. Evolution of rice stripe virus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).
- Wu, W., et al. Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects. PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).
- Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).
- Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence. Scientific Reports. 6, 38082 (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Huo, Y., et al. Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus. Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Huo, Y., et al. Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).
- Bao, Y. Y., et al. De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response. Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).
- Elzinga, D. A., Jander, G. The role of protein effectors in plant-aphid interactions. Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).
- Bos, J. I., et al. A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid). PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).
- Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach. Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).
- Cao, T. T., Lü, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion. Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).
- De Vos, M., Jander, G. Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell & Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).
- Wang, L., et al. Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera. Scientific Reports. 6, 36254 (2016).
- Wang, Y., et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths. Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).
- Wang, W., et al. Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).
- Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).
- Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).
- Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. Clock genes show circadian rhythms in salivary glands. Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).
- Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).
- Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation. Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).
- Shangguan, X., et al. A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants. Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).
- Petrova, A., Smith, C. M. Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa. Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).
- Zhu, J., et al. Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus. GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).
- Van Bel, A. J., Will, T. Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids. Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).
- Perez-Vilar, J., Hill, R. L. The structure and assembly of secreted mucins. The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).
- Pitino, M., Hogenhout, S. A. Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).
- Zhang, F., Zhu, L., He, G. Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice. Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).
- Hogenhout, S. A., Ammar, E. -. D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects. Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).
