Método sanduíche de membrana de duas camadas para laodelphax striatellus saliva collection
Summary
O presente protocolo descreve um método para coletar saliva suficiente de insetos que sugam piercings usando um meio artificial. Este é um método conveniente para coletar saliva de insetos e estudar a função salivar no comportamento de alimentação de insetos e transmissão de vírus transmitidos por vetores.
Abstract
O vírus da tarja de arroz (RSV), que causa perda econômica significativa da agricultura no leste da Ásia, depende inteiramente de vetores de insetos para sua transmissão efetiva entre o arroz hospedeiro. Laodelphax striatellus (pequeno planthopper marrom, SBPH) é o vetor de insetos primário que transmite horizontalmente RSV enquanto suga seiva do phloem. A saliva desempenha um papel significativo no comportamento alimentar dos insetos. Um método conveniente que será útil para pesquisas sobre a saliva de insetos com comportamento de alimentação sugador de piercings é descrito aqui. Neste método, os insetos foram autorizados a se alimentar de uma dieta artificial sanduíche entre duas camadas de filme de parafina esticadas. A dieta contendo a saliva era coletada todos os dias, filtrada e concentrada para análise posterior. Por fim, a qualidade da saliva coletada foi examinada por manchas de proteína e imunoblotting. Este método foi exemplificado pela detecção da presença de RSV e de uma proteína semelhante à mucina na saliva de SBPH. Estes métodos artificiais de alimentação e coleta de saliva estabelecerão uma base para novas pesquisas sobre fatores na saliva de insetos relacionados ao comportamento alimentar e transmissão do vírus.
Introduction
O vírus da tarja de arroz (RSV), um vírus de RNA de ram-tease com fios negativos no gênero Tenuivirus,causa doenças graves na produção de arroz na Ásia Oriental1,2,3. A transmissão de RSV de plantas de arroz infectadas para as saudáveis depende de vetores de insetos, principalmente Laodelphax striatellus, que transmite RSV de forma persistente-propagativa. A SBPH adquire o vírus após se alimentar de plantas infectadas pelo RSV. Uma vez dentro do inseto, o RSV infecta a célula epitelial midgut um dia após a alimentação e, em seguida, passa através da barreira midgut para penetrar o hemolífio. Posteriormente, o RSV se espalha em diferentes tecidos através do hemoglifo e, em seguida, se propaga. Após um período latente de cerca de 10-14 dias após a aquisição, o vírus dentro da glândula salivar pode ser transmitido para as plantas hospedeiras saudáveis através da saliva secretada enquanto a SBPH suga a seiva do phloem4,5,6,7,8,9,10 . Um processo de alimentação eficiente e vários fatores na saliva são essenciais para a disseminação do RSV do inseto para a planta hospedeira.
Acredita-se que a saliva de insetos secretada por glândulas salivares media insetos, vírus e plantas hospedeiras. Insetos hemipteranos geralmente produzem dois tipos de saliva: saliva de gelagem e saliva a aguada11,12,13. A saliva de gelagem é principalmente secretada no apoplasmo para sustentar o movimento do estilo entre as células hospedeiras e também está relacionada à superação da resistência vegetal e respostas imunes14,15,16,17. Na fase de sondagem da alimentação, os insetos secretam intermitentemente a saliva de gelagem que imediatamente é oxidada para formar uma flange superficial. Em seguida, baias simples ou ramificadas envolvem o estilo para reservar um canal tubular18,19,20. Presume-se que a flange superficial na epiderme facilite a penetração do estonte com o estopi, servindo como ponto de ancoragem, enquanto as baias ao redor do estilo podem proporcionar estabilidade mecânica e lubrificação16,21,22,23. A NISHP foi identificada como uma proteína essencial para a formação da baia salivar e a alimentação bem sucedida do planthopper marrom (Nilaparvata lugens, BPH). A inibição da expressão da proteína de baia estrutural (PCH) secretada pelo mímpo acyrthosiphon phid reduziu sua reprodução interrompendo a alimentação dos tubos de peneira hospedeira24. Além disso, em algumas espécies de insetos, fatores de saliva de gel devem desencadear respostas imunes às plantas, formando os chamados padrões moleculares associados ao herbívoro (HAMPs). Em N. lugens, NLMLP, uma proteína semelhante à mucina relacionada à formação de baia, induz defesas vegetais contra a alimentação, incluindo morte celular, expressão de genes relacionados à defesa, e callose deposição 25,26. Além disso, alguns fatores de saliva de gel em pulgões têm sido provados para desencadear respostas de defesa vegetal através de interações gene-gene-gene semelhantes aos padrões moleculares associados ao patógeno12,15,27.
Para estudar os fatores salivares essenciais para a alimentação de insetos e/ou transmissão de patógenos, é necessário analisar a saliva secretada. Aqui, métodos de alimentação artificial e coleta para obter quantidades suficientes de saliva são descritos para análise posterior. Utilizando um meio contendo apenas um único elemento nutricional, muitas proteínas salivares foram coletadas e analisadas por manchas de prata e manchas ocidentais. Este método será útil em mais pesquisas sobre fatores na saliva que são essenciais para a transmissão de RSV pela SBPH.
Protocol
Representative Results
Discussion
A criação bem sucedida de insetos em dietas artificiais foi relatada pela primeira vez em 1962, quando Mittler e Dadd descreveram a técnica de membrana parafina para manter uma dieta artificial29,30. E esse método tem sido explorado em muitos aspectos da biologia e comportamento de insetos, por exemplo, suplemento de nutrientes, alimentação de dsRNA e aquisição de vírus. Com base nos requisitos da análise da saliva, 5% da sacarose é utilizada como diet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (nº 2019YFC1200503), pela Fundação Nacional de Ciência da China (No. 32072385) e pela Associação de Promoção da Inovação Juvenil CAS (2021084).
Materials
| 10-KD centrifugal filter | Merck Millipore | R5PA83496 | For concentration |
| 10x Protein Transfer Buffer(wet) | macGENE | MP008 | Transfer buffer for western blotting |
| 10x TBST buffer | Coolaber | SL1328-500mL×10 | Wash buffer for western blotting |
| Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Imaging system for western blotting and silver staining |
| Color Prestained protein ladder | GenStar | M221-01 | Protein marker for western blotting |
| ECL western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | Western blotting detection |
| Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit | TIANGEN | #PA110 | Chromogenic reaction |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Sigma | 401393-2ML | Polyclonal secondary antibody for western blotting |
| Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | Transfer membrane for western blotting |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | For quantitative real-time PCR (qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RB | For filtration |
| Mini-PROTEAB TGX Gels | Bio-Rad | 4561043 | For SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Detection of protein concentration |
| Nylon membrane | PALL | T42754 | Membrane for dot-ELISA |
| Parafilm M Membrane | Sigma | P7793-1EA | Making artifical diet sandwichs |
| Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides | Genstript | Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting | |
| Rabbit anti-RSV polyclonal antibody | Genstript | Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA | |
| RNAprep pure Micro Kit | TIANGEN | DP420 | For RNA Extraction |
References
- Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
- Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Virus. The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).
- He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. Evolution of rice stripe virus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).
- Wu, W., et al. Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects. PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).
- Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).
- Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence. Scientific Reports. 6, 38082 (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Huo, Y., et al. Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus. Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Huo, Y., et al. Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).
- Bao, Y. Y., et al. De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response. Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).
- Elzinga, D. A., Jander, G. The role of protein effectors in plant-aphid interactions. Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).
- Bos, J. I., et al. A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid). PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).
- Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach. Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).
- Cao, T. T., Lü, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion. Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).
- De Vos, M., Jander, G. Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell & Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).
- Wang, L., et al. Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera. Scientific Reports. 6, 36254 (2016).
- Wang, Y., et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths. Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).
- Wang, W., et al. Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).
- Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).
- Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).
- Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. Clock genes show circadian rhythms in salivary glands. Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).
- Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).
- Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation. Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).
- Shangguan, X., et al. A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants. Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).
- Petrova, A., Smith, C. M. Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa. Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).
- Zhu, J., et al. Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus. GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).
- Van Bel, A. J., Will, T. Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids. Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).
- Perez-Vilar, J., Hill, R. L. The structure and assembly of secreted mucins. The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).
- Pitino, M., Hogenhout, S. A. Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).
- Zhang, F., Zhu, L., He, G. Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice. Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).
- Hogenhout, S. A., Ammar, E. -. D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects. Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).
