Método sándwich de membrana de dos capas para la recolección de saliva de Laodelphax striatellus
Summary
El presente protocolo describe un método para recolectar suficiente saliva de insectos perforantes-chupadores utilizando un medio artificial. Este es un método conveniente para recolectar saliva de insectos y estudiar la función salival en el comportamiento de alimentación de insectos y la transmisión de virus transmitidos por vectores.
Abstract
El virus de la franja de arroz (VRS), que causa una pérdida económica significativa de la agricultura en Asia oriental, depende completamente de los insectos vectores para su transmisión efectiva entre el arroz huésped. Laodelphax striatellus (pequeño saltamontes marrón, SBPH) es el principal vector de insectos que transmite horizontalmente el VSR mientras chupa la savia del floema. La saliva juega un papel importante en el comportamiento de alimentación de los insectos. Aquí se describe un método conveniente que será útil para la investigación de la saliva de los insectos con un comportamiento de alimentación penetrante-chupador. En este método, se permitió que los insectos se alimentaran de una dieta artificial intercalada entre dos capas de película de parafina estiradas. La dieta que contenía la saliva se recolectaba cada día, se filtraba y se concentraba para su posterior análisis. Finalmente, la calidad de la saliva recolectada se examinó mediante tinción de proteínas e inmunoblotting. Este método se ejemplificó mediante la detección de la presencia de VRS y una proteína similar a la mucina en la saliva de SBPH. Estos métodos artificiales de alimentación y recolección de saliva sentarán las bases para una mayor investigación sobre los factores en la saliva de los insectos relacionados con el comportamiento de alimentación y la transmisión del virus.
Introduction
El virus de la raya de arroz (VRS), un virus de ARN de cadena negativa en el género Tenuivirus,causa enfermedades graves en la producción de arroz en Asia oriental1,2,3. La transmisión del VSR de las plantas de arroz infectadas a las sanas depende de los insectos vectores, principalmente Laodelphax striatellus, que transmite el VSR de manera persistente-propagativa. SBPH adquiere el virus después de alimentarse de plantas infectadas por el VSR. Una vez dentro del insecto, el VSR infecta la célula epitelial del intestino medio un día después de la alimentación y luego pasa a través de la barrera del intestino medio para penetrar la hemolinfa. Posteriormente, el VSR se propaga a diferentes tejidos a través de la hemolinfa y luego se propaga. Después de un período latente de aproximadamente 10-14 días después de la adquisición, el virus dentro de la glándula salival puede transmitirse a las plantas huésped sanas a través de la saliva secretada, mientras que SBPHchupa la savia del floema4,5,6,7,8,9,10 . Un proceso de alimentación eficiente y varios factores en la saliva son esenciales para la propagación del VRS del insecto a la planta huésped.
Se cree que la saliva de insecto secretada por las glándulas salivales media insectos, virus y plantas huésped. Los insectos hemípteros suelen producir dos tipos de saliva: saliva gelificante y saliva acuosa11,12,13. La saliva gelificante se secreta principalmente en el apoplasma para mantener el movimiento del estilete entre las células huésped y también se relaciona con la superación de la resistencia de las plantas y las respuestas inmunes14,15,16,17. En la etapa de sondeo de la alimentación, los insectos secretan intermitentemente saliva gelificante que inmediatamente se oxida para formar una brida superficial. Luego, las vainas simples o ramificadas encierran el estilete para reservar un canal tubular18,19,20. Se presume que la brida superficial en la epidermis facilita la penetración del estilete al servir como punto de anclaje, mientras que las vainas alrededor del estilete pueden proporcionar estabilidad mecánica y lubricación16,21,22,23. Nlshp fue identificado como una proteína esencial para la formación de vaina salival y la alimentación exitosa desaltamontes marrones (Nilaparvata lugens,BPH). La inhibición de la expresión de la proteína de la vaina estructural (SHP) secretada por el pulgón Acyrthosiphon pisum redujo su reproducción al interrumpir la alimentación de los tubos del tamiz del huésped24. Además, en algunas especies de insectos, se supone que los factores de saliva en gel desencadenan las respuestas inmunes de las plantas al formar los llamados patrones moleculares asociados a herbívoros (HAMP). En N. lugens,NlMLP, una proteína similar a la mucina relacionada con la formación de vaina, induce las defensas de las plantas contra la alimentación, incluida la muerte celular, la expresión de genes relacionados con la defensa y la deposición de callosa 25,26. Además, se ha demostrado que algunos factores de saliva en gel en los áfidos desencadenan respuestas de defensa de las plantas a través de interacciones de gen a gen similares a los patrones moleculares asociados a patógenos12,15,27.
Para estudiar los factores de saliva esenciales para la alimentación de insectos y / o la transmisión de patógenos, es necesario analizar la saliva secretada. Aquí, se describen métodos artificiales de alimentación y recolección para obtener cantidades suficientes de saliva para un análisis más detallado. Utilizando un medio que contenía un solo elemento nutricional, se recolectaron y analizaron muchas proteínas de saliva mediante tinción de plata y western blotting. Este método será útil en futuras investigaciones sobre los factores en la saliva que son esenciales para la transmisión del VSR por SBPH.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cría exitosa de insectos en dietas artificiales se informó por primera vez en 1962 cuando Mittler y Dadd describieron la técnica de membrana de parafina para mantener una dieta artificial29,30. Y este método se ha explorado en muchos aspectos de la biología y el comportamiento de los insectos, por ejemplo, suplementos nutricionales, alimentación con dsRNA y adquisición de virus. Según los requisitos del análisis de saliva, la sacarosa al 5% se utiliza…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (No. 2019YFC1200503), por la Fundación Nacional de Ciencias de China (No. 32072385) y por la Asociación de Promoción de la Innovación Juvenil CAS (2021084).
Materials
| 10-KD centrifugal filter | Merck Millipore | R5PA83496 | For concentration |
| 10x Protein Transfer Buffer(wet) | macGENE | MP008 | Transfer buffer for western blotting |
| 10x TBST buffer | Coolaber | SL1328-500mL×10 | Wash buffer for western blotting |
| Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Imaging system for western blotting and silver staining |
| Color Prestained protein ladder | GenStar | M221-01 | Protein marker for western blotting |
| ECL western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | Western blotting detection |
| Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit | TIANGEN | #PA110 | Chromogenic reaction |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Sigma | 401393-2ML | Polyclonal secondary antibody for western blotting |
| Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | Transfer membrane for western blotting |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | For quantitative real-time PCR (qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RB | For filtration |
| Mini-PROTEAB TGX Gels | Bio-Rad | 4561043 | For SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Detection of protein concentration |
| Nylon membrane | PALL | T42754 | Membrane for dot-ELISA |
| Parafilm M Membrane | Sigma | P7793-1EA | Making artifical diet sandwichs |
| Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides | Genstript | Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting | |
| Rabbit anti-RSV polyclonal antibody | Genstript | Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA | |
| RNAprep pure Micro Kit | TIANGEN | DP420 | For RNA Extraction |
References
- Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
- Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Virus. The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).
- He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. Evolution of rice stripe virus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).
- Wu, W., et al. Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects. PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).
- Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).
- Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence. Scientific Reports. 6, 38082 (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Huo, Y., et al. Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus. Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Huo, Y., et al. Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).
- Bao, Y. Y., et al. De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response. Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).
- Elzinga, D. A., Jander, G. The role of protein effectors in plant-aphid interactions. Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).
- Bos, J. I., et al. A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid). PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).
- Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach. Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).
- Cao, T. T., Lü, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion. Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).
- De Vos, M., Jander, G. Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell & Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).
- Wang, L., et al. Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera. Scientific Reports. 6, 36254 (2016).
- Wang, Y., et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths. Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).
- Wang, W., et al. Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).
- Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).
- Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).
- Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. Clock genes show circadian rhythms in salivary glands. Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).
- Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).
- Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation. Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).
- Shangguan, X., et al. A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants. Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).
- Petrova, A., Smith, C. M. Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa. Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).
- Zhu, J., et al. Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus. GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).
- Van Bel, A. J., Will, T. Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids. Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).
- Perez-Vilar, J., Hill, R. L. The structure and assembly of secreted mucins. The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).
- Pitino, M., Hogenhout, S. A. Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).
- Zhang, F., Zhu, L., He, G. Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice. Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).
- Hogenhout, S. A., Ammar, E. -. D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects. Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).
