Metodo sandwich a membrana a due strati per la raccolta della saliva di Laodelphax striatellus
Summary
Il presente protocollo descrive un metodo per raccogliere una quantità sufficiente di saliva dagli insetti che succhiano il piercing usando un mezzo artificiale. Questo è un metodo conveniente per raccogliere la saliva degli insetti e studiare la funzione salivare sul comportamento di alimentazione degli insetti e sulla trasmissione del virus trasmesso da vettori.
Abstract
Il virus della striscia di riso (RSV), che causa una significativa perdita economica dell’agricoltura in Asia orientale, dipende interamente dagli insetti vettori per la sua efficace trasmissione tra il riso ospite. Laodelphax striatellus (piccola planthopper marrone, SBPH) è il principale insetto vettore che trasmette orizzontalmente RSV mentre succhia la linfa dal floema. La saliva svolge un ruolo significativo nel comportamento alimentare degli insetti. Un metodo conveniente che sarà utile per la ricerca sulla saliva degli insetti con comportamento alimentare piercing-sucking è descritto qui. In questo metodo, agli insetti è stato permesso di nutrirsi di una dieta artificiale inserita tra due strati di film di paraffina allungati. La dieta contenente la saliva è stata raccolta ogni giorno, filtrata e concentrata per ulteriori analisi. Infine, la qualità della saliva raccolta è stata esaminata mediante colorazione proteica e immunoblotting. Questo metodo è stato esemplificato rilevando la presenza di RSV e di una proteina simile alla mucina nella saliva di SBPH. Questi metodi di alimentazione artificiale e di raccolta della saliva getteranno le basi per ulteriori ricerche sui fattori nella saliva degli insetti legati al comportamento alimentare e alla trasmissione del virus.
Introduction
Il virus della striscia di riso (RSV), un virus a RNA a filamento negativo nel genere Tenuivirus,causa gravi malattie nella produzione di riso in Asia orientale1,2,3. La trasmissione di RSV da piante di riso infette a quelle sane dipende da insetti vettori, principalmente Laodelphax striatellus, che trasmette RSV in modo persistente-propagativo. SBPH acquisisce il virus dopo essersi nutrito di piante infette da RSV. Una volta all’interno dell’insetto, RSV infetta la cellula epiteliale dell’intestino medio un giorno dopo l’alimentazione e poi passa attraverso la barriera dell’intestino medio per penetrare nell’emolinfa. Successivamente, RSV si diffonde in diversi tessuti attraverso l’emolinfa e poi si propaga. Dopo un periodo latente di circa 10-14 giorni dopo l’acquisizione, il virus all’interno della ghiandola salivare può essere trasmesso alle piante ospiti sane attraverso la saliva secreta mentre SBPH succhia la linfa dal floema4,5,6,7,8,9,10 . Un processo di alimentazione efficiente e vari fattori nella saliva sono essenziali per la diffusione di RSV dall’insetto alla pianta ospite.
Si ritiene che la saliva degli insetti secreta dalle ghiandole salivari mediti insetti, virus e piante ospiti. Gli insetti emitteri di solito producono due tipi di saliva: saliva gelificante e saliva acquosa11,12,13. La saliva gelificante è principalmente secreta nell’apoplasma per sostenere il movimento dello stylet tra le cellule ospiti ed è anche correlata al superamento della resistenza delle piante e delle risposte immunitarie14,15,16,17. Nella fase di sondaggio dell’alimentazione, gli insetti secernono a intermittenza saliva gelificante che viene immediatamente ossidata per formare una flangia superficiale. Quindi, guaine singole o ramificate racchiudono lo stylet per riservare un canale tubolare18,19,20. Si presume che la flangia superficiale sull’epidermide faciliti la penetrazione dello stylet fungendo da punto di ancoraggio, mentre le guaine attorno allo stylet possono fornire stabilità meccanica e lubrificazione16,21,22,23. Nlshp è stato identificato come una proteina essenziale per la formazione della guaina salivare e l’alimentazione di successo della ceppa marrone (Nilaparvata lugens, BPH). L’inibizione dell’espressione della proteina guaina strutturale (SHP) secreta dall’afide Acyrthosiphon pisum ha ridotto la sua riproduzione interrompendo l’alimentazione dai tubi del setaccio ospite24. Inoltre, in alcune specie di insetti, si suppone che i fattori della saliva gel inneschino le risposte immunitarie delle piante formando i cosiddetti modelli molecolari associati agli erbivori (HAMPs). In N. lugens,NlMLP, una proteina simile alla mucina correlata alla formazione di guaina, induce difese vegetali contro l’alimentazione, tra cui la morte cellulare, l’espressione di geni legati alla difesa e la deposizione di callosio 25,26. Inoltre, alcuni fattori di saliva gel negli afidi hanno dimostrato di innescare risposte di difesa delle piante attraverso interazioni gene-to-gene simili ai modelli molecolari associati ai patogeni12,15,27.
Per studiare i fattori salivari essenziali per l’alimentazione degli insetti e/o la trasmissione di agenti patogeni, è necessario analizzare la saliva secreta. Qui, l’alimentazione artificiale e i metodi di raccolta per ottenere quantità sufficienti di saliva sono descritti per ulteriori analisi. Utilizzando un mezzo contenente un solo elemento nutrizionale, molte proteine della saliva sono state raccolte e analizzate mediante colorazione dell’argento e western blotting. Questo metodo sarà utile in ulteriori ricerche sui fattori nella saliva che sono essenziali per la trasmissione di RSV da parte di SBPH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il successo dell’allevamento di insetti con diete artificiali è stato segnalato per la prima volta nel 1962 quando Mittler e Dadd hanno descritto la tecnica della membrana di paraffina per tenere una dieta artificiale29,30. E questo metodo è stato esplorato in molti aspetti della biologia e del comportamento degli insetti, ad esempio l’integrazione di nutrienti, l’alimentazione di dsRNA e l’acquisizione di virus. Sulla base dei requisiti dell’analisi della sali…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (n. 2019YFC1200503), dalla National Science Foundation of China (n. 32072385) e dalla Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084).
Materials
| 10-KD centrifugal filter | Merck Millipore | R5PA83496 | For concentration |
| 10x Protein Transfer Buffer(wet) | macGENE | MP008 | Transfer buffer for western blotting |
| 10x TBST buffer | Coolaber | SL1328-500mL×10 | Wash buffer for western blotting |
| Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Imaging system for western blotting and silver staining |
| Color Prestained protein ladder | GenStar | M221-01 | Protein marker for western blotting |
| ECL western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | Western blotting detection |
| Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit | TIANGEN | #PA110 | Chromogenic reaction |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Sigma | 401393-2ML | Polyclonal secondary antibody for western blotting |
| Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | Transfer membrane for western blotting |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | For quantitative real-time PCR (qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RB | For filtration |
| Mini-PROTEAB TGX Gels | Bio-Rad | 4561043 | For SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Detection of protein concentration |
| Nylon membrane | PALL | T42754 | Membrane for dot-ELISA |
| Parafilm M Membrane | Sigma | P7793-1EA | Making artifical diet sandwichs |
| Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides | Genstript | Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting | |
| Rabbit anti-RSV polyclonal antibody | Genstript | Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA | |
| RNAprep pure Micro Kit | TIANGEN | DP420 | For RNA Extraction |
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