Двухслойный мембранный сэндвич-метод для сбора слюны Laodelphax striatellus
Summary
Настоящий протокол описывает способ сбора достаточного количества слюны от прокалывающих сосущих насекомых с использованием искусственной среды. Это удобный метод сбора слюны насекомых и изучения функции слюны на питание насекомых и передачу вируса-переносчика.
Abstract
Вирус рисовых полос (РСВ), который приводит к значительным экономическим потерям в сельском хозяйстве в Восточной Азии, полностью зависит от насекомых-переносчиков для его эффективной передачи среди риса-хозяина. Laodelphax striatellus (маленький коричневый плантхоппер, SBPH) является основным насекомым-переносчиком, который горизонтально передает RSV, всасывая сок из флоэмы. Слюна играет значительную роль в пищевом поведении насекомых. Здесь описан удобный метод, который будет полезен для исследования слюны насекомых с пронзительно-сосущим пищевым поведением. В этом методе насекомым разрешалось питаться на искусственной диете, зажатой между двумя растянутыми слоями парафиновой пленки. Диету, содержащую слюну, собирали каждый день, фильтровали и концентрировали для дальнейшего анализа. Наконец, качество собранной слюны исследовали путем окрашивания белка и иммуноблоттинга. Этот метод был проиллюстрирован обнаружением присутствия RSV и муцин-подобного белка в слюне SBPH. Эти методы искусственного вскармливания и сбора слюны заложат основу для дальнейших исследований факторов слюны насекомых, связанных с пищевым поведением и передачей вируса.
Introduction
Вирус рисовой полосы (RSV), отрицательно-цепочечный РНК-вирус рода Tenuivirus,вызывает тяжелые заболевания в производстве риса в Восточной Азии1,2,3. Передача РСВ от зараженных рисовых растений здоровым растениям зависит от насекомых-переносчиков, главным образом Laodelphax striatellus, которые передают РСВ стойко-размножающимся образом. SBPH приобретает вирус после питания растениями, инфицированными RSV. Попав внутрь насекомого, RSV заражает эпителиальную клетку средней кишки через день после кормления, а затем проходит через барьер средней кишки, чтобы проникнуть в гемолимфу. Впоследствии РСВ распространяется в различные ткани через гемолимфу, а затем распространяется. После латентного периода около 10-14 дней после приобретения вирус внутри слюнной железы может передаваться здоровым растениям-хозяевам через секретируемую слюну, в то время как SBPH высасывает сок из флоэмы4,5,6,7,8,9,10 . Эффективный процесс кормления и различные факторы в слюне необходимы для распространения РСВ от насекомого к растению-хозяину.
Считается, что слюна насекомых, выделяемая слюнными железами, опосредует насекомых, вирусы и растения-хозяева. Гемиптерановые насекомые обычно производят два типа слюны: желющую слюну и водянистую слюну11,12,13. Гелеобразующая слюна в основном секретируется в апоплазму для поддержания движения стайлета среди клеток-хозяев, а также связана с преодолением устойчивости растений и иммунных реакций14,15,16,17. На стадии зондирования кормления насекомые периодически выделяют желую слюну, которая сразу же окисляется с образованием поверхностного фланца. Затем одиночные или разветвленные оболочки обволакивают стильет для резервирования трубчатого канала18,19,20. Предполагается, что поверхностный фланец на эпидермисе облегчает проникновение в стилет, служа опорной точкой, в то время как оболочки вокруг стиля могут обеспечивать механическую стабильность и смазку16,21,22,23. Nlshp был идентифицирован как необходимый белок для образования слюнной оболочки и успешного питания бурого плантхоппера(Nilaparvata lugens,ДГПЖ). Ингибирование экспрессии белка структурной оболочки (SHP), секретируемого тлей Acyrthosiphon pisum, уменьшало ее размножение, нарушая питание из ситовых трубок хозяина24. Более того, у некоторых видов насекомых гелевые факторы слюны должны вызывать иммунные реакции растений, формируя так называемые травоядные молекулярные паттерны (HAMP). В N. lugensNlMLP, муциноподобный белок, связанный с образованием оболочки, индуцирует защиту растений от кормления, включая гибель клеток, экспрессию генов, связанных с защитой, и отложение каллозы 25,26. Кроме того, было доказано, что некоторые факторы слюны геля у тли вызывают реакции защиты растений через взаимодействия генов с геном, аналогичные патоген-ассоциированным молекулярным паттернам12,15,27.
Для изучения факторов слюны, необходимых для питания насекомых и/или передачи патогена, необходимо проанализировать секретируемую слюну. Здесь описаны методы искусственного вскармливания и сбора для получения достаточного количества слюны для дальнейшего анализа. Используя среду, содержащую только один питательный элемент, многие белки слюны были собраны и проанализированы путем окрашивания серебром и вестерн-блоттинга. Этот метод будет полезен в дальнейших исследованиях факторов в слюне, которые необходимы для передачи РСВ SBPH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Об успешном выращивании насекомых на искусственных диетах впервые сообщалось в 1962году,когда Миттлер и Дадд описали технику парафиновой мембраны для проведения искусственной диеты29,30. И этот метод был исследован во многих аспектах биологии и поведения ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (No 2019YFC1200503), Национальным научным фондом Китая (No 32072385) и Ассоциацией содействия инновациям молодежи CAS (2021084).
Materials
| 10-KD centrifugal filter | Merck Millipore | R5PA83496 | For concentration |
| 10x Protein Transfer Buffer(wet) | macGENE | MP008 | Transfer buffer for western blotting |
| 10x TBST buffer | Coolaber | SL1328-500mL×10 | Wash buffer for western blotting |
| Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Imaging system for western blotting and silver staining |
| Color Prestained protein ladder | GenStar | M221-01 | Protein marker for western blotting |
| ECL western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | Western blotting detection |
| Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit | TIANGEN | #PA110 | Chromogenic reaction |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Sigma | 401393-2ML | Polyclonal secondary antibody for western blotting |
| Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | Transfer membrane for western blotting |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | For quantitative real-time PCR (qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RB | For filtration |
| Mini-PROTEAB TGX Gels | Bio-Rad | 4561043 | For SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Detection of protein concentration |
| Nylon membrane | PALL | T42754 | Membrane for dot-ELISA |
| Parafilm M Membrane | Sigma | P7793-1EA | Making artifical diet sandwichs |
| Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides | Genstript | Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting | |
| Rabbit anti-RSV polyclonal antibody | Genstript | Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA | |
| RNAprep pure Micro Kit | TIANGEN | DP420 | For RNA Extraction |
References
- Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
- Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Virus. The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).
- He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. Evolution of rice stripe virus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).
- Wu, W., et al. Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects. PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).
- Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).
- Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence. Scientific Reports. 6, 38082 (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Huo, Y., et al. Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus. Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Huo, Y., et al. Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).
- Bao, Y. Y., et al. De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response. Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).
- Elzinga, D. A., Jander, G. The role of protein effectors in plant-aphid interactions. Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).
- Bos, J. I., et al. A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid). PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).
- Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach. Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).
- Cao, T. T., Lü, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion. Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).
- De Vos, M., Jander, G. Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell & Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).
- Wang, L., et al. Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera. Scientific Reports. 6, 36254 (2016).
- Wang, Y., et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths. Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).
- Wang, W., et al. Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).
- Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).
- Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).
- Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. Clock genes show circadian rhythms in salivary glands. Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).
- Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).
- Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation. Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).
- Shangguan, X., et al. A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants. Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).
- Petrova, A., Smith, C. M. Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa. Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).
- Zhu, J., et al. Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus. GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).
- Van Bel, A. J., Will, T. Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids. Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).
- Perez-Vilar, J., Hill, R. L. The structure and assembly of secreted mucins. The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).
- Pitino, M., Hogenhout, S. A. Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).
- Zhang, F., Zhu, L., He, G. Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice. Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).
- Hogenhout, S. A., Ammar, E. -. D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects. Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).
