Tri cellulaire activé par fluorescence - Tissu traité par radioligand (FACS-RTT) pour déterminer l’origine cellulaire du signal radioactif
Summary
Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) est un outil puissant pour étudier le rôle de la protéine translocatrice 18 kDa ou de l’expression du récepteur 5HT2A de la sérotonine dans la maladie d’Alzheimer à l’échelle cellulaire. Ce protocole décrit l’application ex vivo de FACS-RTT dans le modèle de rat TgF344-AD.
Abstract
Les cellules gliales ont probablement une implication considérable dans la physiopathologie des troubles neurodégénératifs, tels que la maladie d’Alzheimer (MA). Leurs altérations sont peut-être associées à un état pro-inflammatoire. La souche de rat TgF344-AD a été conçue pour exprimer les gènes humains APP et PS1ΔE9 humains, codant pour les protéines amyloïdes Aβ-40 et Aβ-42 et présente une pathologie amyloïde et des déficits cognitifs avec le vieillissement. Le modèle de rat TgF344-AD est utilisé dans cette étude pour évaluer l’origine cellulaire de la liaison à la protéine translocatrice de 18 kDa (TSPO, un marqueur de l’activation des cellules gliales) et les niveaux du récepteur 5HT2A (5HT2AR) de la sérotonine qui sont éventuellement perturbés dans la MA. La technique présentée ici est le tri cellulaire activé par fluorescence sur les tissus traités par radioligand (FACS-RTT), une technique quantitative spécifique au type cellulaire complémentaire aux techniques d’autoradiographie in vivo TEP ou TEMP ou ex vivo /in vitro . Il quantifie le même traceur radiomarqué utilisé auparavant pour l’imagerie, en utilisant un compteur de γ après le tri cellulaire de cytométrie. Cela permet de déterminer l’origine cellulaire de la protéine radiomarquée avec une spécificité et une sensibilité cellulaires élevées. Par exemple, des études avec FACS-RTT ont montré que (i) l’augmentation de la liaison tSPO était associée à la microglie dans un modèle de rat de neuroinflammation induite par les lipopolysaccharides (LPS), (ii) une augmentation de la liaison au TSPO à 12 et 18 mois était d’abord associée aux astrocytes, puis à la microglie chez les rats TgF344-AD par rapport aux rats de type sauvage (WT), et (iii) à la densité striatale de 5HT2A R diminue dans les astrocytes à 18 mois dans le même modèle de MA de rat. Fait intéressant, cette technique peut être étendue à pratiquement tous les radiotraceurs.
Introduction
Les maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer (MA), se caractérisent par une perte neuronale associée à une augmentation des symptômes. La MA, la cause la plus fréquente de démence, représentant 60% à 70% des cas, touche environ 50 millions de personnes dans le monde1. Au niveau neuropathologique, les deux principales caractéristiques de la MA sont l’accumulation de plaques extracellulaires de β amyloïde (Aβ) et d’enchevêtrements neurofibrillaires tau intracellulaires. Des altérations des cellules gliales ont également été associées à laMA 2 et à la perturbation possible de plusieurs systèmes de neurotransmetteurs 3,4.
La lignée de rats TgF344-AD a été modifiée pour modéliser la MA en exprimant les transgènes humains APP et PS1ΔE9, conduisant à l’expression soluble et insoluble d’Aβ-40 et d’Aβ-42 et à la formation de plaque amyloïde5. Il présente également l’accumulation de formes hyperphosphorylées de la protéine Tau conduisant à la tauopathie. À partir de l’âge de 9 à 24 mois, les rats développent progressivement les caractéristiques pathologiques de la MA et une déficience cognitive 5,6,7,8,9.
La tomographie par émission de positons (TEP), la tomographie par émission monophotonique (TEMP) et l’autoradiographie sont des techniques basées sur l’émission et la quantification de rayons γ. Les radiotraceurs sont quantifiés soit in vivo (TEP et TEMP), soit ex vivo/in vitro (autoradiographie). Ces techniques sensibles ont contribué à la compréhension des mécanismes de plusieurs maladies du cerveau, telles que la MA. En effet, en termes de neuroinflammation, il existe de nombreuses études évaluant la protéine translocatrice 18 kDa (TSPO), un marqueur de neuroinflammation in vivo, avec des traceurs radiomarqués tels que [11C]-(R)-PK11195 ou [11C]PBR28 (pour examen voir10). En outre, les altérations des systèmes de neurotransmetteurs ont été étudiées à l’aide de radiotraceurs 11,12,13.
Cependant, ces techniques ne déterminent pas l’origine cellulaire du signal radioactif. Cela pourrait entraver l’interprétation des fondements biologiques de l’altération de la liaison d’un radioligand dans la TEP/TEMP. Par exemple, dans le cas des études TSPO sur la neuroinflammation, il est d’une importance primordiale de comprendre si l’augmentation ou la diminution de la TSPO est due à des changements astrocytaires ou microgliaux. La technique FACS-RTT (Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue) a été développée pour contourner ces problèmes, permettant l’évaluation de la liaison radioligand dans chaque type de cellule séparément et la quantification de la densité protéique cible par cellule. Cette technique innovante est donc complémentaire et hautement compatible avec l’imagerie TEP et TEMP.
Ici, cette technique a été appliquée selon deux axes: l’étude de la neuroinflammation à l’aide de radioligands spécifiques de TSPO et l’évaluation du système sérotoninergique. Sur le premier axe, l’objectif était de comprendre l’origine cellulaire du signal TSPO en réponse à une réaction inflammatoire aiguë. Par conséquent, FACS-RTT a été utilisé sur les tissus cérébraux de rats après l’induction de la neuroinflammation par injection de lipopolysaccharide (LPS) et à la suite d’une étude d’imagerie in vivo [125I]CLINDE SPECT. De plus, la même imagerie et le même protocole FACS-RTT ont été appliqués sur des rats TgF344-AD âgés de 12 et 24 mois et sur des rats de type sauvage (WT) correspondants. Le deuxième axe visait à déterminer l’origine des altérations du système sérotoninergique dans ce modèle de rat par l’évaluation ex vivo de la densité 5-HT2AR par type de cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
À notre connaissance, cette technique a été la première à décrire une approche qui permet de mieux comprendre les altérations de liaison in vivo d’un radiotraceur au niveau cellulaire. Le protocole décrit une méthode multi-échelle pour quantifier la liaison des radiotraceurs au niveau cellulaire en utilisant [125I]CLINDE (TSPO) ou [125I]R91150 (5HT2AR) comme exemples.
Cette technique est suffisamment robuste et sensible pour détecter avec …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Fonds national suisse de la recherche scientifique (subvention n° 320030-184713). Les auteurs BBT et KC sont soutenus par la Fondation Velux (projet n. 1123). L’auteur ST a reçu le soutien du Fonds national suisse de la recherche scientifique (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), la Fondation Prof. Dr. Max Cloetta (bourse Médecine Clinique Plus), et la Fondation Jean et Madeleine Vachoux.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
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