Tessuto trattato con radioligandi attivati da fluorescenza per determinare l'origine cellulare del segnale radioattivo
Summary
Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) è un potente strumento per studiare il ruolo della proteina traslocatore 18 kDa o dell’espressione del recettore della serotonina 5HT2A nella malattia di Alzheimer su scala cellulare. Questo protocollo descrive l’applicazione ex-vivo di FACS-RTT nel modello di ratto TgF344-AD.
Abstract
Le cellule gliali hanno probabilmente una notevole implicazione nella fisiopatologia delle malattie neurodegenerative, come il morbo di Alzheimer (AD). Le loro alterazioni sono forse associate a uno stato pro-infiammatorio. Il ceppo di ratto TgF344-AD è stato progettato per esprimere i geni umani APP e PS1ΔE9 umani, codificando per le proteine amiloidi Aβ-40 e Aβ-42 e mostra patologia amiloide e deficit cognitivi con l’invecchiamento. Il modello di ratto TgF344-AD viene utilizzato in questo studio per valutare l’origine cellulare del legame della proteina traslocatrice 18 kDa (TSPO, un marcatore di attivazione delle cellule gliali) e dei livelli del recettore della serotonina 5HT2A (5HT2AR) che sono potenzialmente interrotti nell’AD. La tecnica qui presentata è Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT), una tecnica quantitativa specifica per tipo cellulare complementare alle tecniche in vivo PET o SPECT o autoradiografia ex vivo / in vitro . Quantifica lo stesso tracciante radiomarcato utilizzato in precedenza per l’imaging, utilizzando un contatore di γ dopo lo smistamento delle cellule citometriche. Ciò consente di determinare l’origine cellulare della proteina radiomarcata con elevata specificità e sensibilità cellulare. Ad esempio, studi con FACS-RTT hanno dimostrato che (i) l’aumento del legame TSPO era associato alla microglia in un modello di ratto di neuroinfiammazione indotta da lipopolisaccaride (LPS), (ii) un aumento del legame TSPO a 12 e 18 mesi è stato associato prima agli astrociti, e poi alla microglia nei ratti TgF344-AD rispetto ai ratti wild type (WT) e (iii) alla densità striatale di 5HT2A R diminuisce negli astrociti a 18 mesi nello stesso modello di AD di ratto. È interessante notare che questa tecnica può essere estesa praticamente a tutti i radiotraccianti.
Introduction
Le malattie neurodegenerative, come il morbo di Alzheimer (AD), sono caratterizzate da una perdita neuronale associata ad un aumento dei sintomi. L’AD, la causa più comune di demenza, che rappresenta il 60%-70% dei casi, colpisce circa 50 milioni di persone in tutto il mondo1. A livello neuropatologico, le due principali caratteristiche dell’AD sono l’accumulo di placche extracellulari amiloide-β (Aβ) e grovigli neurofibrillari intracellulari Tau. Alterazioni delle cellule gliali sono state anche associate all’AD2 e alla possibile interruzione di diversi sistemi di neurotrasmettitori 3,4.
La linea di ratto TgF344-AD è stata modificata nel modello AD esprimendo transgeni umani APP e PS1ΔE9, portando all’espressione solubile e insolubile di Aβ-40 e Aβ-42 e alla formazione di placche amiloidi5. Presenta anche l’accumulo di forme iperfosforilate della proteina Tau che porta alla tauopatia. Dall’età di 9-24 mesi, i ratti sviluppano progressivamente i segni patologici dell’AD e un deterioramento cognitivo 5,6,7,8,9.
La tomografia ad emissione di positroni (PET), la tomografia computerizzata a emissione di fotoni singoli (SPECT) e l’autoradiografia sono tecniche basate sull’emissione e la quantificazione dei raggi γ. I radiotraccianti sono quantificati in vivo (PET e SPECT) o ex vivo/in vitro (autoradiografia). Queste tecniche sensibili hanno contribuito alla comprensione dei meccanismi di diverse malattie cerebrali, come l’AD. In effetti, in termini di neuroinfiammazione, ci sono molti studi che valutano 18 kDa Translocator Protein (TSPO), un marcatore di neuroinfiammazione in vivo, con traccianti radiomarcati come [11C]-(R)-PK11195 o [11C]PBR28 (per la revisione vedi10). Inoltre, le alterazioni dei sistemi di neurotrasmettitori sono state studiate utilizzando radiotraccianti 11,12,13.
Tuttavia, tali tecniche non determinano l’origine cellulare del segnale radioattivo. Ciò potrebbe ostacolare l’interpretazione delle basi biologiche dell’alterazione del legame di un radioligando in PET/SPECT. Ad esempio, nel caso degli studi TSPO sulla neuroinfiammazione, capire se l’aumento o la diminuzione del TSPO è dovuto a cambiamenti astrocitici o microgliali è di fondamentale importanza. La tecnica FACS-RTT (Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue) è stata sviluppata per aggirare questi problemi, consentendo la valutazione del legame radioligante in ogni tipo di cellula separatamente e la quantificazione della densità della proteina bersaglio per cellula. Questa tecnica innovativa è quindi complementare e altamente compatibile con l’imaging PET e SPECT.
Qui, questa tecnica è stata applicata lungo due assi: lo studio della neuroinfiammazione utilizzando radioligandi TSPO-specifici e la valutazione del sistema serotoninergico. Sul primo asse, l’obiettivo era quello di comprendere l’origine cellulare del segnale TSPO in risposta a una reazione infiammatoria acuta. Pertanto, FACS-RTT è stato utilizzato sui tessuti cerebrali dei ratti dopo l’induzione della neuroinfiammazione tramite iniezione di lipopolisaccaride (LPS) e a seguito di uno studio di imaging in vivo [125I]CLINDE SPECT. Inoltre, lo stesso imaging e lo stesso protocollo FACS-RTT sono stati applicati su ratti TgF344-AD di 12 e 24 mesi e ratti wild-type (WT) corrispondenti. Il secondo asse mirava a determinare l’origine delle alterazioni del sistema serotoninergico in questo modello di ratto tramite la valutazione della densità ex vivo 5-HT2AR per tipo di cellula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per quanto ne sappiamo, questa tecnica è stata la prima a descrivere un approccio che consente una migliore comprensione delle alterazioni di legame in vivo di un radiotracciante a livello cellulare. Il protocollo descrive un metodo multiscala per quantificare il legame del radiotracciante a livello cellulare usando [125I]CLINDE (TSPO) o [125I]R91150 (5HT2AR) come esempi.
Questa tecnica è abbastanza robusta e sensibile da rilevare con precisione l’or…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica (sovvenzione n. 320030-184713). Gli autori BBT e KC sono sostenuti dalla Fondazione Velux (progetto n. 1123). L’autore ST ha ricevuto il sostegno del Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), la Fondazione Prof Dr. Max Cloetta (borsa di studio Clinical Medicine Plus) e la Fondazione Jean e Madeleine Vachoux.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
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