荧光活化细胞分选-放射性配体处理组织（FACS-RTT）以确定放射性信号的细胞来源
Summary
荧光激活细胞分选 – 放射性配体处理组织（FACS-RTT）是研究18 kDa易位蛋白或血清素5HT2A受体表达在细胞尺度上阿尔茨海默病中的作用的强大工具。该协议描述了FACS-RTT在TgF344-AD大鼠模型中的 离体 应用。
Abstract
神经胶质细胞可能在神经退行性疾病（如阿尔茨海默病（AD））的病理生理学中具有相当大的影响。它们的改变可能与促炎状态有关。TgF344-AD大鼠菌株设计用于表达人类APP和人类PS1ΔE9 基因，编码淀粉样蛋白Aβ-40和Aβ-42，并随着年龄的增长显示淀粉样蛋白病理学和认知缺陷。本研究使用TgF344-AD大鼠模型来评估18 kDa易位蛋白（TSPO，神经胶质细胞活化的标志物）结合的细胞起源，以及可能在AD中破坏的5HT2A受体（5HT2AR）血清素受体水平。这里介绍的技术是荧光活化细胞分选为放射性配体处理组织（FACS-RTT），这是一种定量细胞类型特异性技术，补充 了体内 PET或SPECT或 离体/体外 放射自显影技术。它在细胞术细胞分选后使用γ计数器量化先前用于成像的相同放射性标记示踪剂。这允许确定具有高细胞特异性和灵敏度的放射性标记蛋白的细胞来源。例如，FACS-RTT的研究表明，（i）脂多糖（LPS）诱导的神经炎症大鼠模型中TSPO结合的增加与小胶质细胞相关，（ii）12个月和18个月时TSPO结合的增加首先与星形胶质细胞相关，然后与野生型（WT）大鼠相比，TgF344-AD大鼠中的小胶质细胞相关，以及（iii）纹状体密度为5HT2A在同一大鼠AD模型中，R在18个月时星形胶质细胞减少。有趣的是，这种技术可以扩展到几乎所有的放射性示踪剂。
Introduction
神经退行性疾病，如阿尔茨海默病（AD），其特征在于与症状增加相关的神经元丢失。AD是痴呆症最常见的原因，占病例的60%-70%，影响全球约5000万人1。在神经病理学水平上，AD的两个主要特征是细胞外淀粉样蛋白β（Aβ）斑块和细胞内Tau神经原纤维缠结的积累。神经胶质细胞改变也与AD2 和几种神经递质系统的可能破坏有关3，4。
TgF344-AD大鼠品系通过表达人APP和PS1ΔE9 转基因来模拟AD，导致可溶性和不溶性Aβ-40和Aβ-42表达以及淀粉样蛋白斑块形成5。它还呈现Tau蛋白的高磷酸化形式的积累，导致tau病。从9-24个月大，大鼠逐渐发展AD的病理标志和认知障碍5，6，7，8，9。
正电子发射断层扫描（PET），单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和放射自显影是基于γ射线发射和定量的技术。放射性示踪剂在体内（PET和SPECT）或离体/体外（放射自显影）进行定量。这些敏感的技术有助于理解几种脑部疾病的机制，如AD。事实上，在神经炎症方面，有很多研究评估18 kDa易位蛋白（TSPO），一种体内神经炎症标志物，放射性标记的示踪剂，如[11C]-（R）-PK11195或[11C]PBR28（综述见10）。此外，已经使用放射性示踪剂11，12，13研究了神经递质系统的改变。
然而，这些技术并不能确定放射性信号的细胞来源。这可能会妨碍对PET / SPECT中放射性配体结合改变的生物学基础的解释。例如，在TSPO神经炎症研究的情况下，了解TSPO的增加或减少是由于星细胞还是小胶质细胞的变化至关重要。荧光活化细胞分选为放射性配体处理组织（FACS-RTT）技术是为了解决这些问题而开发的，允许分别评估每种细胞类型中的放射性配体结合并量化每个细胞的靶蛋白密度。因此，这种创新技术与PET和SPECT成像相辅相成且高度兼容。
在这里，该技术沿两个轴应用：使用TSPO特异性放射性配体研究神经炎症和评估5-羟色胺能系统。在第一个轴上，目的是了解TSPO信号响应急性炎症反应的细胞起源。因此，在通过脂多糖（LPS）注射诱导神经炎症后，以及在 体内 [125I]CLINDE SPECT成像研究之后，FACS-RTT用于大鼠的脑组织。此外，对12个月和24个月大的TgF344-AD大鼠和匹配的野生型（WT）大鼠应用相同的成像和FACS-RTT方案。第二轴旨在通过按细胞类型 进行离体 5-HT2AR密度评估来确定该大鼠模型中5-羟色胺能系统改变的起源。
Protocol
Representative Results
Discussion
据我们所知，该技术是第一个描述一种方法的方法，该方法可以更好地了解细胞水平上放射性示踪剂的体内结合改变。该协议描述了一种多尺度方法，以[125 I]CLINDE（TSPO）或[125I]R91150（5HT2AR）为例，在细胞水平上量化放射性示踪剂结合。
该技术足够强大且灵敏，可以精确检测广谱神经胶质细胞改变的细胞起源，从LPS诱导的强烈炎症反应到AD大鼠?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了瑞士国家科学基金会的支持（拨款320030-184713）。作者BBT和KC得到了Velux基金会（项目号1123）的支持。作者ST获得了瑞士国家科学基金会的支持（早期博士后流动奖学金，No.P2GEP3_191446），Max Cloetta教授基金会（临床医学加奖学金）和Jean和Madeleine Vachoux基金会。
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
- Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer’s disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
- Kinney, J. W., et al. Inflammation as a central mechanism in Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia. 4, 575-590 (2018).
- D’Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer’s disease: Translating basic science into clinical practice. Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).
- D’Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer’s disease: Bridging the gap between mice and humans. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).
- Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).
- Morrone, C. D., et al. Regional differences in Alzheimer’s disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-β attenuation. Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).
- Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer’s disease rats in the Morris Water Task. Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).
- Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer’s disease: A preliminary approach. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer’s disease. Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).
- Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyzériat, K., Garibotto, V., Millet, P. In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer’s disease. Cells. 9 (9), (2020).
- Backes, H. [11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors. NeuroImage. 207, 116346 (2020).
- Millet, P., et al. Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images. NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).
- Tsartsalis, S., et al. A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images. Molecular Imaging. 13 (8), (2014).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
- Tournier, B. B., et al. Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).
