蛍光活性化細胞選別-放射性リガンド処理組織(FACS-RTT)による放射性シグナルの細胞起源の決定
Summary
蛍光活性化細胞選別 – 放射性リガンド処理組織(FACS-RTT)は、アルツハイマー病における18 kDaトランスロケータータンパク質またはセロトニン5HT2A受容体発現の役割を細胞規模で研究するための強力なツールです。このプロトコールは、TgF344−ADラットモデルにおけるFACS−RTTの エクスビボ 適用を記載する。
Abstract
グリア細胞は、おそらくアルツハイマー病(AD)などの神経変性疾患の病態生理学においてかなりの意味を持つ。それらの変化は、おそらく炎症誘発状態と関連している。TgF344-ADラット株は、アミロイドタンパク質Aβ-40およびAβ-42をコードするヒトAPPおよびヒトPS1ΔE9 遺伝子を発現するように設計されており、加齢に伴うアミロイド病態および認知障害を示す。本研究では、TgF344-ADラットモデルを用いて、18kDaのトランスロケータータンパク質(TSPO、グリア細胞活性化のマーカー)結合の細胞起源、およびADにおいて破壊される可能性のある5HT2A受容体(5HT2AR)セロトニン受容体レベルを評価する。ここで紹介する技術は、Radioligand Treated Tissue(FACS-RTT)への蛍光活性化細胞選別であり、 in vivo PETまたはSPECTまたは ex vivo/in vitro オートラジオグラフィー技術を補完する定量的細胞型特異的技術である。画像化の前に使用したのと同じ放射性標識トレーサーを定量し、細胞選別後にサイトメトリーカウンター γを使用する。これにより、高い細胞特異性および感度を有する放射性標識タンパク質の細胞起源を決定することができる。例えば、FACS-RTTを用いた研究では、(i)リポ多糖(LPS)誘発神経炎症のラットモデルにおけるTSPO結合の増加がミクログリアと関連していたこと、(ii)12ヶ月および18ヶ月でのTSPO結合の増加が最初にアストロサイトと関連し、次にTgF344-ADラットにおけるミクログリアが野生型(WT)ラットと比較して、および(iii)5HT2Aの線条体密度に関連していたことが示されました。Rは、同じラットADモデルにおいて18ヶ月でアストロサイトにおいて減少する。興味深いことに、この技術は事実上すべての放射性トレーサーに拡張することができます。
Introduction
アルツハイマー病(AD)などの神経変性疾患は、症状の増加に伴う神経細胞喪失によって特徴付けられる。認知症の最も一般的な原因であるADは、症例の60%〜70%を占め、世界中で約5,000万人が罹患しています1。神経病理学的レベルでは、ADの2つの主要な特徴は、細胞外アミロイドβ(Aβ)プラークおよび細胞内タウ神経原線維のもつれの蓄積である。グリア細胞の変化はまた、AD2 およびいくつかの神経伝達物質系の可能な破壊と関連している3、4。
TgF344-ADラット株は、ヒトAPPおよびPS1ΔE9導入遺伝子を発現することによってADをモデル化するように改変され、可溶性および不溶性のAβ−40およびAβ−42発現およびアミロイドプラーク形成5をもたらす。それはまた、タウオパチーにつながるタウタンパク質の過剰リン酸化形態の蓄積を提示する。9〜24ヶ月齢から、ラットはADの病理学的特徴および認知障害5,6,7,8,9を徐々に発症する。
陽電子放射断層撮影(PET)、単一光子放射コンピュータ断層撮影(SPECT)、およびオートラジオグラフィーは、γ光線の放出および定量化に基づく技術である。放射性トレーサーは、インビボ(PETおよびSPECT)またはエキソビボ/インビトロ(オートラジオグラフィー)のいずれかで定量化される。これらの敏感な技術は、ADなどのいくつかの脳疾患のメカニズムの理解に貢献してきました。実際、神経炎症に関しては、in vivo神経炎症マーカーである18kDaトランスロケータータンパク質(TSPO)を、[11C]-(R)-PK11195または[11C]PBR28などの放射性標識トレーサーで評価する多くの研究がある(レビューについては10を参照)。加えて、神経伝達物質系の変化は、放射性トレーサー11、12、13を用いて研究されている。
しかしながら、これらの技術は、放射性シグナルの細胞起源を決定しない。これは、PET/SPECTにおける放射性リガンドの結合における変化の生物学的基盤の解釈を妨げる可能性がある。例えば、神経炎症のTSPO研究の場合、TSPOの増加または減少がアストロサイトまたはミクログリアの変化によるものかどうかを理解することが最も重要である。放射性リガンド処理組織への蛍光活性化細胞選別(FACS-RTT)技術は、これらの問題を回避するために開発され、すべての細胞タイプにおける放射性リガンド結合を個別に評価し、細胞あたりの標的タンパク質密度を定量化することができます。この革新的な技術は、PETおよびSPECTイメージングと補完的で高い互換性があります。
ここで、この技術は、TSPO特異的放射性リガンドを用いた神経炎症の研究とセロトニン作動系の評価の2つの軸に沿って適用された。第1の軸では、目的は、急性炎症反応に応答するTSPOシグナルの細胞起源を理解することであった。したがって、FACS-RTTは、リポ多糖(LPS)注射を介して神経炎症を誘導した後、およびin vivo [125I]CLINDE SPECTイメージング研究に続いてラットの脳組織に使用された。さらに、12ヶ月齢および24ヶ月齢のTgF344-ADラットおよび一致する野生型(WT)ラットに、同じイメージングおよびFACS−RTTプロトコルを適用した。第2の軸は、細胞型によるエクスビボ5−HT2AR密度評価を介してこのラットモデルにおけるセロトニン作動性系変化の起源を決定することを目的とした。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々の知る限り、この技術は、細胞レベルでの放射性トレーサーのin vivo結合変化のよりよい理解を可能にするアプローチを最初に記述した。このプロトコルは、[125 I]クリンド(TSPO)または[125 I]R91150(5HT 2AR)を例として使用して細胞レベルで放射性トレーサー結合を定量化するマルチスケール法を記載している。
この技術は、LPSによって誘導?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究はスイス国立科学財団(助成金番号320030-184713)の支援を受けた。著者BBTとKCは、Velux Foundation(プロジェクト番号1123)の支援を受けています。著者STはスイス国立科学財団(早期ポスドクモビリティ奨学金、いいえ。P2GEP3_191446)、マックス・クロエッタ教授(臨床医学プラス奨学金)、ジャン・アンド・マドレーヌ・ヴァシュー財団。
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
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