형광-활성화된 세포 분류-방사성 신호의 세포 기원을 결정하기 위한 방사성리간드 처리조직(FACS-RTT)
Summary
형광-활성화된 세포 분류-방사성리간드 처리된 조직(FACS-RTT)은 알츠하이머병에서 세포 규모로 18kDa 트랜스로케이터 단백질 또는 세로토닌 5HT2A-수용체 발현의 역할을 연구하는 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 TgF344-AD 래트 모델에서 FACS-RTT의 생체외 적용을 기술한다.
Abstract
신경교세포는 아마도 알츠하이머병(AD)과 같은 신경퇴행성 장애의 병태생리학에 상당한 영향을 미칠 것이다. 그들의 변화는 아마도 전염증성 상태와 관련이 있습니다. TgF344-AD 래트 균주는 아밀로이드 단백질 Aβ-40 및 Aβ-42를 코딩하는 인간 APP와 인간 PS1ΔE9 유전자를 발현하도록 설계되었으며 노화와 함께 아밀로이드 병리학 및 인지 결핍을 나타낸다. TgF344-AD 래트 모델은 AD에서 교란될 가능성이 있는 18 kDa 트랜스로케이터 단백질 (TSPO, 신경교세포 활성화의 마커) 결합 및 5HT 2A 수용체 (5HT2AR) 세로토닌 수용체 수준의 세포 기원을 평가하기 위해 본 연구에 사용된다. 여기에 제시된 기술은 방사성 리간드 처리 조직에 대한 형광 활성화 세포 분류 (FACS-RTT), 생체 내 PET 또는 SPECT 또는 생체 외 / 시험관 내 자가방사선 촬영 기술과 보완적인 정량적 세포 유형 특이적 기술입니다. 그것은 세포 측정 세포 분류 후 γ 카운터를 사용하여 이미징에 이전에 사용 된 것과 동일한 방사성 표지 추적기를 정량화합니다. 이것은 높은 세포 특이성 및 민감도를 갖는 방사성 표지된 단백질의 세포 기원을 결정할 수 있게 한다. 예를 들어, FACS-RTT를 사용한 연구는 (i) TSPO 결합의 증가가 리포폴리사카라이드(LPS)-유도된 신경염증의 래트 모델에서 미세아교세포와 연관되었고, (ii) 12개월 및 18개월에서의 TSPO 결합의 증가는 성상세포와 먼저 연관되었고, 이어서 야생형(WT) 래트와 비교하여 TgF344-AD 래트에서의 미세아교세포, 및 (iii)5HT2A의 삼중항 밀도와 관련이 있다는 것을 보여주었다. R은 동일한 래트 AD 모델에서 18개월에 성상세포에서 감소한다. 흥미롭게도,이 기술은 거의 모든 방사선 추적기로 확장 될 수 있습니다.
Introduction
알츠하이머 병 (AD)과 같은 신경 퇴행성 질환은 증상 증가와 관련된 신경 세포 손실을 특징으로합니다. 치매의 가장 흔한 원인 인 AD는 사례의 60 % -70 %를 차지하며 전 세계 약 5 천만 명의 사람들에게 영향을 미칩니다1. 신경 병리학 적 수준에서 AD의 두 가지 주요 특징은 세포 외 아밀로이드 β (Aβ) 플라크와 세포 내 타우 신경 세동 엉킴의 축적입니다. 신경교 세포 변화는 또한 AD2 및 여러 신경 전달 물질 시스템 3,4의 가능한 파괴와 관련이 있습니다.
TgF344-AD 래트 라인은 인간 APP 및 PS1ΔE9 전이유전자를 발현함으로써 AD를 모델로 변형시켜 가용성 및 불용성 Aβ-40 및 Aβ-42 발현 및 아밀로이드 플라크 형성5를 유도하였다. 또한 타우병증으로 이어지는 타우 단백질의 과인산화 형태의 축적을 제시한다. 9-24 개월의 나이부터, 쥐는 점차적으로 AD의 병리학 적 특징과인지 장애 5,6,7,8,9를 개발합니다.
양전자 방출 단층 촬영 (PET), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT) 및 자기 방사선 촬영은 γ선의 방출 및 정량화에 기반한 기술입니다. 방사성 추적기는 생체 내 (PET 및 SPECT) 또는 생체 외 / 시험관 내 (자기 방사선 촬영)에서 정량화됩니다. 이러한 민감한 기술은 AD와 같은 여러 뇌 질환의 메커니즘에 대한 이해에 기여했습니다. 실제로, 신경 염증의 관점에서, [11 C]-(R)-PK11195 또는 [11C]PBR28과 같은 방사성 표지 추적기를 갖는 생체내 신경염증 마커인 18 kDa 트랜스로케이터 단백질 (TSPO)을 평가하는 많은 연구가 있다 (검토를 위해10 참조). 또한, 신경 전달 물질 시스템의 변화는 방사성 추적기11,12,13을 사용하여 연구되었습니다.
그러나, 이러한 기술들은 방사성 신호의 세포 기원을 결정하지 않는다. 이것은 PET/SPECT에서 방사성 리간드의 결합의 변경에 대한 생물학적 토대에 대한 해석을 방해할 수 있다. 예를 들어, 신경 염증에 대한 TSPO 연구의 경우, TSPO의 증가 또는 감소가 성상세포 또는 미세 아교 변화로 인한 것인지 여부를 이해하는 것이 가장 중요합니다. 방사성리간드 처리된 조직으로의 형광-활성화 세포 분류(FACS-RTT) 기술은 이러한 문제를 해결하기 위해 개발되었으며, 이를 통해 모든 세포 유형에서 방사성리간드 결합을 개별적으로 평가하고 세포당 표적 단백질 밀도를 정량화할 수 있습니다. 이 혁신적인 기술은 결과적으로 보완적이며 PET 및 SPECT 이미징과 매우 호환됩니다.
여기에서이 기술은 TSPO 특이적 방사성 리간드를 사용한 신경 염증 연구와 세로토닌성 시스템을 평가하는 두 축을 따라 적용되었습니다. 첫 번째 축에서, 목표는 급성 염증 반응에 반응하여 TSPO 신호의 세포 기원을 이해하는 것이 었습니다. 따라서, FACS-RTT는 리포폴리사카라이드(LPS) 주사를 통해 신경염증을 유도한 후 생체내 [125I]CLINDE SPECT 이미징 연구를 통해 래트의 뇌 조직에 사용되었다. 또한, 동일한 이미징 및 FACS-RTT 프로토콜이 12개월 및 24개월령의 TgF344-AD 래트 및 매칭된 야생형(WT) 래트에 적용되었다. 두 번째 축은 세포 유형별 생체외 5-HT2A R 밀도 평가를 통해 이러한 래트 모델에서 세로토닌성 시스템 변경의기원을 결정하는 것을 목표로 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리의 지식에 따르면,이 기술은 세포 수준에서 방사성 추적기의 생체 내 결합 변경에 대한 더 나은 이해를 가능하게하는 접근법을 설명하는 최초의 기술이었습니다. 이 프로토콜은 예로서 [125 I]CLINDE (TSPO) 또는 [125I]R91150 (5HT2AR)을 사용하여 세포 수준에서 방사성 추적자 결합을 정량화하는 다중스케일 방법을 기술한다.
이 기술은 LPS에 의해 유?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 스위스 국립 과학 재단 (보조금 번호 320030-184713)의 지원을 받았다. 저자 BBT와 KC는 Velux Foundation (프로젝트 n. 1123)의 지원을 받습니다. 저자 ST는 스위스 국립 과학 재단 (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus 장학금) 교수, Jean and Madeleine Vachoux Foundation.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
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