Fluorescensaktivert cellesortering-radioligog behandlet vev (FACS-RTT) for å bestemme cellulær opprinnelse av radioaktivt signal
Summary
Fluorescensaktivert cellesortering-radioligog behandlet vev (FACS-RTT) er et kraftig verktøy for å studere rollen til 18 kDa translokatorprotein eller Serotonin 5HT2A-reseptoruttrykk i Alzheimers sykdom i cellulær skala. Denne protokollen beskriver ex-vivo-applikasjonen av FACS-RTT i TgF344-AD-rottemodellen.
Abstract
Glialceller har sannsynligvis en betydelig implikasjon i patofysiologien til nevrodegenerative lidelser, som Alzheimers sykdom (AD). Deres endringer er kanskje forbundet med en proinflammatorisk tilstand. TgF344-AD rottestammen er designet for å uttrykke human APP og menneskelige PS1ΔE9-gener , koding for amyloidproteiner Aβ-40 og Aβ-42 og viser amyloidpatologi og kognitive underskudd med aldring. TgF344-AD rottemodellen brukes i denne studien til å evaluere den cellulære opprinnelsen til 18 kDa translokatorprotein (TSPO, en markør for glial celleaktivering) binding, og 5HT2A-reseptoren (5HT2AR) serotoninreseptornivåer som muligens forstyrres i AD. Teknikken som presenteres her er fluorescensaktivert cellesortering til radioligand behandlet vev (FACS-RTT), en kvantitativ celletypespesifikk teknikk komplementær til in vivo PET eller SPECT eller ex vivo / in vitro autoradiografiteknikker. Den kvantifiserer den samme radiomerkede sporingsenheten som ble brukt før avbildning, ved hjelp av en γ teller etter cytometricellesortering. Dette gjør det mulig å bestemme den cellulære opprinnelsen til det radiomerkede proteinet med høy cellulær spesifisitet og følsomhet. For eksempel viste studier med FACS-RTT at (i) økningen i TSPO-binding var forbundet med mikroglia i en rottemodell av lipopolysakkarid (LPS)-indusert nevroinflammasjon, (ii) en økning i TSPO-binding ved 12- og 18-måneders var først forbundet med astrocytter, og deretter mikroglia hos TgF344-AD-rotter sammenlignet med villtype (WT) rotter, og (iii) den striatale tettheten på 5HT2A R minker i astrocytter ved 18 måneder i samme rotte AD-modell. Interessant nok kan denne teknikken utvides til nesten alle radiotracers.
Introduction
Nevrodegenerative sykdommer, som Alzheimers sykdom (AD), er preget av et nevronalt tap forbundet med økte symptomer. AD, den vanligste årsaken til demens, som står for 60% -70% av tilfellene, påvirker rundt 50 millioner mennesker over hele verden1. På et nevropatisk nivå er de to viktigste egenskapene til AD akkumulering av ekstracellulære amyloid-β (Aβ) plakk og intracellulære Tau nevrofibrillære tangles. Glial celle endringer har også vært assosiert med AD2 og mulig forstyrrelse av flere nevrotransmitter systemer 3,4.
TgF344-AD rottelinjen er modifisert til modell AD ved å uttrykke human APP og PS1ΔE9 transgenes, noe som fører til løselig og uoppløselig Aβ-40 og Aβ-42 uttrykk og amyloid plakkdannelse5. Det presenterer også akkumulering av hyperfosforrylaterte former for Tau-proteinet som fører til tauopati. Fra en alder av 9-24 måneder utvikler rottene gradvis de patologiske kjennetegnene til AD og en kognitiv svikt 5,6,7,8,9.
Positron Emission Tomography (PET), Single-Photon Emission computed Tomography (SPECT) og autoradiografi er teknikker basert på utslipp og kvantifisering av γ stråler. Radiotracers kvantifiseres enten in vivo (PET og SPECT) eller ex vivo/in vitro (autoradiografi). Disse sensitive teknikkene har bidratt til forståelsen av mekanismer for flere hjernesykdommer, for eksempel AD. Faktisk, når det gjelder nevroinflammasjon, er det mange studier som vurderer 18 kDa translokatorprotein (TSPO), en in vivo neuroinflammation-markør, med radiomerkede sporstoffer som [11C]-(R)-PK11195 eller [11C]PBR28 (for gjennomgang se10). I tillegg er endringer av nevrotransmittersystemer studert ved hjelp av radiotracers 11,12,13.
Disse teknikkene bestemmer imidlertid ikke den cellulære opprinnelsen til det radioaktive signalet. Dette kan hemme tolkningen av de biologiske understøttelsene av endringen i bindingen av en radioligog i PET/SPECT. For eksempel, når det gjelder TSPO-studier av nevroinflammasjon, er det viktig å forstå om økningen eller reduksjonen av TSPO skyldes astrocytiske eller mikrogliale endringer. Fluorescensaktivert cellesortering til radioligandbehandlet vev (FACS-RTT) ble utviklet for å omgå disse problemene, slik at vurderingen av radioligog binding i hver celletype separat og kvantifisering av målproteintetthet per celle. Denne innovative teknikken er følgelig komplementær og svært kompatibel med PET- og SPECT-avbildning.
Her ble denne teknikken brukt langs to akser: studiet av nevroinflammasjon ved hjelp av TSPO-spesifikke radioligander og vurdering av det serotonergiske systemet. På den første aksen var målet å forstå den cellulære opprinnelsen til TSPO-signalet som svar på en akutt inflammatorisk reaksjon. Derfor ble FACS-RTT brukt på hjernevev av rotter etter induksjon av nevroinflammasjon via en lipopolysakkarid (LPS) injeksjon og etter en in vivo [125I]CLINDE SPECT maging studie. Videre ble den samme bilde- og FACS-RTT-protokollen brukt på 12- og 24 måneder gamle TgF344-AD-rotter og matchende villtype (WT) rotter. Den andre aksen hadde som mål å bestemme opprinnelsen til serotoninergiske systemendringer i denne rottemodellen via ex vivo 5-HT2AR tetthetsvurdering etter celletype.
Protocol
Representative Results
Discussion
Så vidt vi vet, var denne teknikken den første til å beskrive en tilnærming som gir en bedre forståelse av in vivo bindende endringer av en radiotracer på cellenivå. Protokollen beskriver en flerskalametode for å kvantifisere radiotracerbinding på cellenivå ved hjelp av [125I]CLINDE (TSPO) eller [125I]R91150 (5HT2AR) som eksempler.
Denne teknikken er robust og følsom nok til å nøyaktig oppdage den cellulære opprinnelsen til et bredt spekt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Swiss National Science Foundation (tilskudd nr. 320030-184713). Forfatterne BBT og KC støttes av Velux Foundation (prosjekt n. 1123). Forfatter ST fikk støtte fra Swiss National Science Foundation (Early Post-Doc Mobility Scholarship, nei. P2GEP3_191446), Prof Dr. Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus stipend), og Jean og Madeleine Vachoux Foundation.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
- Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer’s disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
- Kinney, J. W., et al. Inflammation as a central mechanism in Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia. 4, 575-590 (2018).
- D’Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer’s disease: Translating basic science into clinical practice. Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).
- D’Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer’s disease: Bridging the gap between mice and humans. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).
- Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).
- Morrone, C. D., et al. Regional differences in Alzheimer’s disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-β attenuation. Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).
- Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer’s disease rats in the Morris Water Task. Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).
- Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer’s disease: A preliminary approach. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer’s disease. Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).
- Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyzériat, K., Garibotto, V., Millet, P. In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer’s disease. Cells. 9 (9), (2020).
- Backes, H. [11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors. NeuroImage. 207, 116346 (2020).
- Millet, P., et al. Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images. NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).
- Tsartsalis, S., et al. A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images. Molecular Imaging. 13 (8), (2014).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
- Tournier, B. B., et al. Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).
