Gnaver estrous cyklus overvågning ved hjælp af vaginal skylning: Ikke sådan noget som en normal cyklus

Summary

Denne undersøgelse beskriver de afgørende faktorer, der skal overvejes i eksperimentelle designs, der involverer hunrotter. I en større forstand tjener disse data til at mindske stigmatisering og hjælpe med udviklingen af mere inkluderende diagnostiske og interventionsværktøjer.

Abstract

Den nuværende metode etablerer en reproducerbar, standardiseret og omkostningseffektiv tilgang til overvågning af den estrouscyklus hos kvindelige Sprague Dawley (SD) unge rotter. Denne undersøgelse demonstrerer kompleksiteten af hormonelle cyklusser og det brede spektrum af forståelse, der kræves for at konstruere en pålidelig og gyldig overvågningsteknik. Gennem en grundig undersøgelse af de vigtigste eksperimentelle design- og proceduremæssige elementer giver denne beskrivelse af cyklussen og dens grundlæggende principper en ramme for yderligere forståelse og dekonstruerer misforståelser til fremtidig replikation.

Sammen med en oversigt over prøveindsamlingsprocessen, der anvender vaginal skylning, beskriver proceduren mekanismen for datakategorisering i firetrinsmodellen af proestrus, østrus, metestrus og diestrus. Disse stadier er kendetegnet ved en ny foreslået tilgang, der anvender de 4 kategoriserende determinanter for vaginal væsketilstand, celletype (r) til stede, cellearrangement og cellemængde på indsamlingstidspunktet. Variationer af hvert trin, gunstige og ugunstige prøver, sondringen mellem cyklisk og acykliskitet og grafiske skildringer af de indsamlede kategoriseringskomponenter præsenteres sammen med effektiv fortolkning og organisatorisk praksis af dataene. Samlet set giver disse værktøjer mulighed for offentliggørelse af kvantificerbare dataområder for første gang, hvilket fører til standardisering af kategoriseringsfaktorer ved replikering.

Introduction

Nye bidrag
Gnaverens østrocyklus er blevet identificeret som en væsentlig indikator for velvære. Imidlertid hindrer ubevidste forstyrrelser af efterforskere og unøjagtige fortolkninger vedrørende den kvindelige krop det videnskabelige samfund. Selve etymologien af ordet “estrous” indebærer en følelse af underlegenhed og negativitet. Euripides brugte udtrykket til at beskrive en “vanvid” eller galskab, Homer til at beskrive panik og Platon til at beskrive en irrationel drift. Denne undersøgelse fremhæver, hvordan disse oprindelige perspektiver påvirker det nuværende videnskabelige samfund og adresserer disse bekymringer gennem et nyt mosaikparadigme – en opdateret kombination af tidligere studerede metoder, udvidet i omfang for en mere omfattende tilgang.

Undersøgelsen og brugen af denne teknik er for det første nødvendig, da der ikke er nogen standardiseret og omfattende overvågningsteknik, og datafortolkningspraksis kan være uklar. For det andet, selvom østrocyklusegenskaber er afhængige af individuelle rotter, der undersøges, er de ofte universaliserede. For det tredje, mens hormonelle cyklusser er rutinemæssige og gavnlige processer, er de omgivet af farlig stigmatisering udforsket i afsnittet ‘Oversættelse til mennesker’. Denne undersøgelse har til formål at løse disse tre problemer på tre måder – (A) ved at beskrive en dybdegående østrøs cyklusovervågningsteknik og afklare, hvordan resultaterne kan fortolkes, (B) ved at skitsere metoder, der opretholder integriteten og individualiteten af hver cyklus, og (C) ved at henlede opmærksomheden på misforståelser, der opretholder udokumenterede praksis.

Denne undersøgelse er også unik i sit fokus på unge rotter, en periode præget af afgørende udviklingsændringer, der kaster lys over forskellige adfærdsmæssige, anatomiske og fysiologiske manifestationer i voksenalderen¹. Opbygning af et standardiseret eksperimentelt design til overvågning af hormoncyklusser i en underforsket population, samtidig med at almindelige forstyrrelser dekonstrueres, vil muliggøre udvikling af pålidelige og gyldige hormonelle korrelationer ^2,3,4 og bestemmelse af tilstandsafhængige cyklusforstyrrelser 5,6,7,8,9,10 . I sidste ende tjener disse nyheder til at udvide diagnostiske kriterier, behandlinger og interventioner af forskellige wellness-bekymringer.

Grundlæggende definitioner og anvendelser
Den østrøse cyklus er en samling af dynamiske fysiologiske processer, der forekommer som reaktion på de tre oscillerende kvindelige kønssteroidhormoner: østradiol, leuteiniserende hormon (LH) og progesteron (figur 1A, B). Interaktioner mellem det endokrine og centralnervesystemet regulerer cyklussen, som oftest vedvarer i 4-5 dage og gentager sig fra begyndelsen af seksuel modning til reproduktiv ældning og / eller ophør. Det er opdelt i separate kategorier baseret på hormonniveauer – oftest i de 4 faser af diestrus (DIE), proestrus (PRO), østrus (EST) og metestrus (MET), som udvikler sig på en cirkulær måde. Antallet af divisioner kan variere fra 3 trin¹¹ til 13 trin¹² afhængigt af undersøgelsens art¹³. Det lavere antal divisioner udelukker ofte MET som en fase og klassificerer det som en overgangsperiode af kort varighed. Det højere tal inkluderer typisk underafsnit, der giver mulighed for en nærmere undersøgelse af fænomener som tumorudvikling eller spontan pseudograviditet, den fysiologiske tilstand af graviditet uden embryonal implantation 12,14,15.

I denne undersøgelse blev stadierne identificeret gennem komponenter i vaginalkanalen, navngivet de 3 kategoriserende determinanter-celletype (r) til stede, cellearrangement og cellemængde (figur 2A-D). Mens tilstanden af vaginalvæsken ikke blev overvåget i denne undersøgelse, anbefales det at inkludere det som en fjerde kategoriseringskomponent. Yderligere oplysninger om undersøgelse af vaginalvæsken findes i referencelisten¹⁶. De kategoriserende komponenter kan undersøges ved at ekstrahere celler via vaginal skylning, den primære teknik, der anbefales i moderne østrocyklusovervågning. Mens de dybtgående fysiologiske processer inden for hvert trin ligger uden for rammerne af denne undersøgelse, kan flere oplysninger findes i litteraturen¹⁷.

Brugen og den fortsatte udvikling af denne østrocyklusovervågningsteknik er forankret i forbindelserne mellem kønssteroidhormoner og funktionen af kropslige systemer såsom det kardiovaskulære system¹⁸, endokrine system⁸ og centralnervesystemet 19,20,21. Samtidig er det ikke altid nødvendigt at overvåge østrocyklus, når hungnavere er involveret 22,23,24,25. Det er snarere vigtigt først at overveje, om kønsforskelle er blevet rapporteret inden for det specifikke undersøgelsesområde, som kan undersøges yderligere i offentliggjorte anmeldelser ^22,23. Selv om overvågning af skumringscyklus er afgørende i et bredt spektrum af forskningsundersøgelser, bør det ikke ses som en hindring for at inkludere hungnavere i forsøg. Selvom denne teknik kan virke kompleks og tidskrævende, kan selve proceduren tage mindre end 15 minutter at gennemføre, afhængigt af efterforskeren, og er omkostningseffektiv. Samlet set er inddragelsen af kvindelige gnavere i videnskabelige undersøgelser fordelagtig for forståelsen af kropslige systemer, forskellige tilstande og patologier og generel velvære, da denne udvikling hovedsageligt har været baseret på den mandlige kropsskabelon.

Universelle parametre og naturlige variationer i gnaveren
Etablering af intervaller for aspekter, der betragtes som “typiske”, er nødvendig for at definere standardcyklusmønstre, indstille parametre til komparative og analytiske formål og detektere abnormiteter og outliers. Samtidig er det også vigtigt at erkende, at hver rottes cyklus er unik, og afvigelser baseret på dyrestamme, fysiologiske processer og miljøforhold forventes. Faktisk er et af de mest “normale” aspekter af den østrøse cyklus variabilitet. Dette ses i den samlede cykluslængde med et interval på 3-38 dage^26,27; alderen for seksuel modning, der kan variere fra 32-34 dage til flere uger 28,29,30; hvad der betragtes som acyklisk¹¹, og de kategoriserende determinantmønstre ^11,13. Samlet set er der ingen universel skabelon for den estrous cyklus, og at oversætte det til både det videnskabelige samfund og offentligheden er en vigtig del af den eksperimentelle proces.

Eksperimentelle tidspunkter og udviklingsalder
At anerkende dette princip om variabilitet hjælper med at opbygge et pålideligt og gyldigt eksperimentelt design. For eksempel er starten på overvågning af østrocykling afhængig af rotternes anatomiske og fysiologiske udvikling, som varierer afhængigt af miljømæssige og fysiologiske faktorer. Overvågning kan ikke begynde før udviklingen af vaginalåbningen (VO), som er den eksterne vaginale åbning omgivet af vulva, der fører til den indre del af vaginalkanalen (figur 3A-D). Mens VO ofte udvikler sig fuldt ud mellem 32 og 34 dage, forbliver den individualiseret til hvert emne, og meget om processen forbliver ukendt. Denne åbning er blevet brugt til at identificere begyndelsen af seksuel modning, som har været forbundet med stigningen i østradiol³¹, modningen af hypothalamus-hypofyse-ovarieaksen³² og den første ægløsning hos rotter 17,33,34,35. Nylige publikationer har imidlertid fundet ud af, at det kun er en indirekte markør for reproduktiv udvikling, da det kan blive afkoblet fra hormonelle og udviklingsmæssige forekomster i ugunstige miljøer³¹ og kan repræsentere ændringer i østradiolniveauer snarere end seksuel modning³³. Derfor anbefales det ikke udelukkende at stole på VO for at bestemme udviklingsalder og som en kvalifikation til overvågning af østruscyklus³⁶, men også at udnytte udseendet af det første EST-trin og cornificering af epitelcellerne³⁰ for at markere begyndelsen af seksuel modning.

Kropsvægt er især korreleret med udviklingsalder i ungdomsperioden hos gnavere^30,37 og kan derfor også hjælpe med at bestemme udviklingsalderen i denne periode. Foreslåede mekanismer relateret til dette fænomen omfatter stimulering af hormoner, der er nødvendige for reproduktiv udvikling, såsom væksthormon, og inhibering af hypothalamus-hypofyse adrenal (HPA) akse af appetitregulatoren, leptin³⁰. Det anbefales dog ikke at bruge denne foranstaltning som den eneste indikator for udviklingsalder på grund af den store varians, der ses mellem rotter på tværs af arter og leverandørudbydere³⁸. Den variation, der ses i udviklingen af VO og kropsvægt, eksemplificerer konceptets betydning i den samlede eksperimentelle proces.

Oversættelse til mennesker: kulturelle og videnskabelige sammenhænge
Det translationelle forhold mellem dyr-til-menneske reproduktive undersøgelser er tovejs. Resultaterne fra dyrebaserede undersøgelser påvirker, hvordan de menneskelige processer vurderes, nærmer sig og analyseres³⁹. Opfattelsen af det menneskelige reproduktive system og dets relaterede processer påvirker, hvordan dyr studeres. Faktisk stammer en af de højeste indikationer for yderligere forskning på dette område fra partiske sociokulturelle overbevisninger relateret til hormonelle cyklusser, der påvirker den videnskabelige proces. Mange af disse konventioner er afledt af en generel kulturel modvilje mod at diskutere menstruation, hvilket har ført til et datagab i velunderbygget viden ^40,41. Dette har et spektrum af konsekvenser, der spænder fra mindre til dødelig – fra reolhøjde og smartphonestørrelse til politiets kropspansertilpasning og ubesvarede kræftdiagnoser⁴².

Beskrivelsen af menstruation som uhygiejnisk, destruktiv og giftig – set i ærede tekster, medier, ordbøger og medicinsk lære – bevares af videnskabelige publikationer. Dette sker gennem unøjagtige og partiske beskrivelser af hormonelle cyklusser, isoleringen af reproduktionssystemet fra dets neuroendokrine modstykker og miljøpåvirkninger og det reduktionistiske perspektiv på afslutningen af en cyklus som en ‘manglende undfangelse’43,44. Dette fører til skabelsen af usund eksperimentel praksis, såsom udeladelse af eksterne variabler, der påvirker hormonelle cyklusser, bestemmelse af start og endepunkter udelukkende baseret på anatomiske udviklinger og måling af cyklusfremskridt på en lineær snarere end cirkulær måde. På trods af den direkte sammenhæng mellem sociokulturelle faktorer og biologiske konsekvenser overvejes det ikke ofte i videnskabelig litteratur. Gennem inspektion af mere holistiske publikationer 43,44,45 kan forskere dekonstruere disse stigmas og skabe mere pålidelige og gyldige eksperimentelle designs.

Protocol

Alle håndterings- og proceduremetoder, der er beskrevet i denne protokol, er i overensstemmelse med National Institutes of Health (NIH) retningslinjer for dyrepleje og brug og er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Pepperdine University og UCLA Chancellor’s Animal Research Committee (ARC). 1. Pleje og brug af dyr Erhverv hunrotter, i antal ifølge effektanalyse, og hanrotter for at fremme Whitten-effekten eller mere konsekvent cykling<sup class…

Representative Results

De nuværende data afspejler det kvindelige unge SD International Genetic Standardization Program (IGS) i nærværelse af mandlige SD-rotter. Disse dyr blev placeret på både Pepperdine University og UCLA laboratorier som en del af en samarbejdsundersøgelse. Figur 5 viser flere variationer af de 4 cyklusfaser. Figur 5A1 blev identificeret som en diestrus-prøve med flere celletyper til stede. Dette eksempel viser, at prøver med et større ant…

Discussion

Vigtige trin og vigtige overvejelser
Visse kritiske trin i den medfølgende protokol kræver vægt, især inden for indsamling af vaginale celler. Under vaginal væskeekstraktion er sikring af den rette vinkel og dybde af sprøjteindsættelse nøglen til at producere tilfredsstillende resultater og i sidste ende forhindre irritation, skade eller cervikal stimulering af dyret. Stimuleringen af livmoderhalsen kan være en kilde til pseudopregnancy induktion, indikeret ved 12-14 dage af en leukocyt-kun v…

Materials

AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera	AmScope	Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5	https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel	Fischer Scientific	14-815-526	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8	NEWCO	93009	https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass	Fischer Scientific	12-553-7A	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses	Fischer Scientific	12-553-464	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fischer Scientific	06-666	https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001	NEWCO Specialty and LabDiet	5012	https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm	Grainger	36UX10	https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9%	Live Action Safety	ABB079830939	https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip – 100 Syringes by BH Supplies	BH Supplies	ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821	https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7& keywords=1ml+sterile+syringe&qid= 1572478649&s=industrial &sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa= ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM 0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja 1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2 xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen	Allentown	LV40326013	https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad	Medline	EAN: 0480196288558  Global Trade Identification Number: 40080196288558	https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853& sr=8-4