Knaagdier Estrous Cycle Monitoring met behulp van vaginale lavage: niet zoiets als een normale cyclus

Summary

Deze studie beschrijft de cruciale factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij experimentele ontwerpen met vrouwelijke ratten. In bredere zin dienen deze gegevens om stigma te verminderen en te helpen bij de ontwikkeling van meer inclusieve diagnostische en interventietools.

Abstract

De huidige methodologie stelt een reproduceerbare, gestandaardiseerde en kosteneffectieve aanpak vast voor het monitoren van de oestruscyclus van vrouwelijke Sprague Dawley (SD) adolescente ratten. Deze studie toont de complexiteit van hormonale cycli en het brede spectrum van begrip dat nodig is om een betrouwbare en geldige monitoringtechniek te construeren. Door middel van een diepgaand onderzoek van de belangrijkste experimentele ontwerp- en procedurele elementen, biedt deze beschrijving van de cyclus en de fundamentele principes ervan een kader voor verder begrip en deconstrueert misvattingen voor toekomstige replicatie.

Samen met een overzicht van het monsterverzamelingsproces met behulp van vaginale lavage, beschrijft de procedure het mechanisme van gegevenscategorisatie in het viertrapsmodel van proestrus, oestrus, metestrus en diestrus. Deze stadia worden gekenmerkt door een nieuwe voorgestelde aanpak, waarbij gebruik wordt gemaakt van de 4 categoriserende determinanten van vaginale vloeistofconditie, aanwezige celtype (s), celschikking en celhoeveelheid op het moment van verzameling. Variaties van elke fase, gunstige en ongunstige steekproeven, het onderscheid tussen cycliciteit en acycliciteit en grafische afbeeldingen van de verzamelde categoriserende componenten worden gepresenteerd naast effectieve interpretatieve en organisatorische praktijken van de gegevens. Over het algemeen maken deze tools het mogelijk om voor het eerst kwantificeerbare gegevensbereiken te publiceren, wat leidt tot de standaardisatie van categorisatiefactoren bij replicatie.

Introduction

Nieuwe bijdragen
De oestruscyclus van knaagdieren is geïdentificeerd als een essentiële indicator van welzijn. Onbewuste vooroordelen van onderzoekers en onnauwkeurige interpretaties met betrekking tot het vrouwelijk lichaam belemmeren echter de wetenschappelijke gemeenschap. De etymologie van het woord “oestrus” impliceert een gevoel van minderwaardigheid en negativiteit. Euripides gebruikte de term om een “razernij” of waanzin te beschrijven, Homerus om paniek te beschrijven en Plato om een irrationele drift te beschrijven. Deze studie benadrukt hoe deze oerperspectieven de huidige wetenschappelijke gemeenschap beïnvloeden en pakt deze zorgen aan door middel van een nieuw mozaïekparadigma – een bijgewerkte combinatie van eerder bestudeerde methoden, uitgebreid in reikwijdte voor een meer omvattende benadering.

De studie en het gebruik van deze techniek zijn ten eerste noodzakelijk, omdat er geen gestandaardiseerde en uitgebreide monitoringtechniek is en gegevensinterpretatiepraktijken onduidelijk kunnen zijn. Ten tweede, hoewel oestruscycluskenmerken afhankelijk zijn van individuele ratten die worden bestudeerd, zijn ze vaak universeel. Ten derde, hoewel hormonale cycli routinematige en nuttige processen zijn, worden ze omgeven door gevaarlijk stigma dat wordt onderzocht in de sectie ‘Vertaling naar mensen’. Deze studie heeft tot doel deze drie problemen op drie manieren aan te pakken- (A) door een diepgaande oestruscyclusmonitoringtechniek te beschrijven en te verduidelijken hoe de resultaten kunnen worden geïnterpreteerd, (B) door methoden te schetsen die de integriteit en individualiteit van elke cyclus behouden, en (C) door de aandacht te vestigen op misvattingen die ongefundeerde praktijken in stand houden.

Deze studie is ook uniek in zijn focus op adolescente ratten, een periode die wordt gekenmerkt door cruciale ontwikkelingsveranderingen die licht werpen op verschillende gedrags-, anatomische en fysiologische manifestaties op volwassen leeftijd¹. Het bouwen van een gestandaardiseerd experimenteel ontwerp om hormonale cycli in een onderbelichte populatie te monitoren en tegelijkertijd gemeenschappelijke vooroordelen te deconstrueren, zal de ontwikkeling van betrouwbare en geldige hormonale correlaties ^2,3,4 en de bepaling van conditieafhankelijke cyclusverstoringen mogelijk maken 5,6,7,8,9,10 . Uiteindelijk dienen deze nieuwigheden om diagnostische criteria, behandelingen en interventies van verschillende welzijnsproblemen uit te breiden.

Fundamentele definities en toepassingen
De oestruscyclus is een verzameling dynamische fysiologische processen die optreden als reactie op de drie oscillerende vrouwelijke geslachtssteroïde hormonen: oestradiol, leuteiniserend hormoon (LH) en progesteron (figuur 1A, B). Interacties tussen het endocriene en centrale zenuwstelsel reguleren de cyclus, die meestal 4-5 dagen aanhoudt en terugkeert vanaf het begin van seksuele rijping tot reproductieve senescentie en / of stopzetting. Het is verdeeld in afzonderlijke categorieën op basis van hormoonspiegels – meestal in de 4 stadia van diestrus (DIE), proestrus (PRO), oestrus (EST) en metestrus (MET), die op een circulaire manier vorderen. Het aantal divisies kan variëren van 3 fasen¹¹ tot 13 fasen¹², afhankelijk van de aard van het onderzoek¹³. Het lagere aantal divisies sluit met als fase vaak uit en classificeert het als een kortdurende overgangsperiode. Het hogere aantal omvat meestal subsecties die een nadere inspectie mogelijk maken van verschijnselen zoals tumorontwikkeling of spontane pseudozwangerschap, de fysiologische toestand van zwangerschap zonder embryonale implantatie 12,14,15.

In deze studie werden de stadia geïdentificeerd door componenten van het vaginale kanaal, genaamd de 3 categoriserende determinanten – aanwezige celtype (s), celschikking en celhoeveelheid (figuur 2A-D). Hoewel de toestand van de vaginale vloeistof niet werd gecontroleerd in deze studie, wordt aanbevolen om het op te nemen als een vierde categoriserende component. Meer informatie over het onderzoeken van de vaginale vloeistof is te vinden in de referentielijst¹⁶. De categoriserende componenten kunnen worden onderzocht door cellen te extraheren via vaginale lavage, de primaire techniek die wordt aanbevolen in de hedendaagse oestruscyclusmonitoring. Hoewel de diepgaande fysiologische processen binnen elke fase buiten het bestek van deze studie vallen, is meer informatie te vinden in de literatuur¹⁷.

Het gebruik en de verdere ontwikkeling van deze oestruscyclusmonitoringtechniek is geworteld in de verbanden tussen geslachtssteroïde hormonen en de functie van lichaamssystemen zoals het cardiovasculaire systeem¹⁸, endocriene systeem⁸ en het centrale zenuwstelsel 19,20,21. Tegelijkertijd is oestruscyclusmonitoring niet altijd nodig wanneer vrouwelijke knaagdieren ^22,23,24,25 betrokken zijn. Integendeel, het is belangrijk om eerst te overwegen of sekseverschillen zijn gemeld in het specifieke studiegebied, dat verder kan worden onderzocht in gepubliceerde beoordelingen^22,23. Hoewel estrouscyclusmonitoring van vitaal belang is in een breed spectrum van onderzoeken, moet het niet worden gezien als een obstakel voor het opnemen van vrouwelijke knaagdieren in experimenten. Hoewel deze techniek complex en tijdrovend kan lijken, kan de procedure zelf minder dan 15 minuten duren om te voltooien, afhankelijk van de onderzoeker, en is kosteneffectief. Over het algemeen is de opname van vrouwelijke knaagdieren in wetenschappelijke studies gunstig voor het begrip van lichaamssystemen, verschillende aandoeningen en pathologieën en algemeen welzijn, omdat deze ontwikkelingen voornamelijk zijn gebaseerd op de mannelijke lichaamssjabloon.

Universele parameters en natuurlijke variabiliteiten bij het knaagdier
Het vaststellen van bereiken voor aspecten die als “typisch” worden beschouwd, is noodzakelijk om standaardcycluspatronen te definiëren, parameters in te stellen voor vergelijkende en analytische doeleinden en afwijkingen en uitschieters te detecteren. Tegelijkertijd is het ook belangrijk om te erkennen dat de cyclus van elke rat uniek is en dat afwijkingen op basis van dierlijke stam, fysiologische processen en omgevingsomstandigheden worden verwacht. In feite is een van de meest “normale” aspecten van de oestruscyclus variabiliteit. Dit is te zien in de totale cycluslengte, met een bereik van 3-38 dagen^26,27; de leeftijd van seksuele rijping die kan variëren van 32-34 dagen tot meerdere weken 28,29,30; wat wordt beschouwd als acyclisch¹¹, en de categoriserende determinante patronen^11,13. Over het algemeen is er geen universeel sjabloon voor de oestruscyclus, en het vertalen daarvan naar zowel de wetenschappelijke gemeenschap als het grote publiek is een belangrijk onderdeel van het experimentele proces.

Experimentele tijdspunten en ontwikkelingsleeftijd
Het herkennen van dit principe van variabiliteit helpt bij het bouwen van een betrouwbaar en geldig experimenteel ontwerp. Het begin van oestruscyclusmonitoring is bijvoorbeeld afhankelijk van de anatomische en fysiologische ontwikkeling van de ratten, die varieert op basis van omgevings- en fysiologische factoren. Monitoring kan niet beginnen tot de ontwikkeling van de vaginale opening (VO), de externe vaginale opening omringd door de vulva die naar het inwendige deel van het vaginale kanaal leidt (figuur 3A-D). Hoewel de VO zich vaak volledig ontwikkelt tussen de leeftijd van 32 en 34 dagen, blijft het geïndividualiseerd voor elk onderwerp en veel over het proces blijft onbekend. Deze opening is gebruikt om het begin van seksuele rijping te identificeren, wat in verband is gebracht met de toename van oestradiol³¹, de rijping van de hypothalamus-hypofyse-ovariële as³² en de eerste ovulatie bij ratten 17,33,34,35. Recente publicaties hebben echter aangetoond dat het slechts een indirecte marker van reproductieve ontwikkeling is, omdat het kan worden losgekoppeld van hormonale en ontwikkelingsgebeurtenissen in ongunstige omgevingen³¹ en veranderingen in oestradiolniveaus kan vertegenwoordigen in plaats van seksuele rijping³³. Daarom wordt aanbevolen om niet alleen op de VO te vertrouwen om de ontwikkelingsleeftijd te bepalen en als een kwalificatie voor oestruscyclusmonitoring³⁶, maar ook om het uiterlijk van de eerste EST-fase en de cornificatie van de epitheelcellen³⁰ te gebruiken om het begin van seksuele rijping te markeren.

Het lichaamsgewicht is met name gecorreleerd met de ontwikkelingsleeftijd tijdens de adolescentieperiode bij knaagdieren^30,37 en kan daarom ook helpen bij het bepalen van de ontwikkelingsleeftijd in deze periode. Voorgestelde mechanismen die verband houden met dit fenomeen omvatten de stimulatie van hormonen die nodig zijn voor de voortplantingsontwikkeling, zoals groeihormoon, en de remming van de hypothalamus-hypofyse bijnier (HPA) -as door de eetlustregulator, leptine³⁰. Het wordt echter niet aanbevolen om deze maatregel te gebruiken als de enige indicator van ontwikkelingsleeftijd vanwege de grote variatie tussen ratten tussen soorten en leveranciers³⁸. De variabiliteit die wordt gezien in de ontwikkeling van de VO en het lichaamsgewicht illustreren het belang van het concept in het algehele experimentele proces.

Vertaling naar de mens: culturele en wetenschappelijke contexten
De translationele relatie van dier-op-mens voortplantingsstudies is bidirectioneel. De resultaten van dierstudies beïnvloeden hoe de menselijke processen worden beoordeeld, benaderd en geanalyseerd³⁹. De perceptie van het menselijke voortplantingssysteem en de bijbehorende processen beïnvloeden hoe dieren worden bestudeerd. In feite komt een van de luidste aanwijzingen voor verder onderzoek op dit gebied voort uit bevooroordeelde sociaal-culturele overtuigingen met betrekking tot hormonale cycli die het wetenschappelijke proces beïnvloeden. Veel van deze conventies zijn afgeleid van een algemene culturele afkeer van het bespreken van menstruatie, wat heeft geleid tot een datakloof in goed onderbouwde kennis ^40,41. Dit heeft een spectrum van gevolgen die zich uitstrekken van klein tot dodelijk – van plankhoogte en smartphonegrootte tot het passen van kogelvrije vesten door de politie en gemiste kankerdiagnoses⁴².

De beschrijving van menstruatie als onhygiënisch, destructief en giftig – gezien in gerespecteerde teksten, media, woordenboeken en medische leringen – wordt bewaard door wetenschappelijke publicaties. Dit gebeurt door onnauwkeurige en bevooroordeelde beschrijvingen van hormonale cycli, de isolatie van het voortplantingssysteem van zijn neuro-endocriene tegenhangers en omgevingsinvloeden, en het reductionistische perspectief van de voltooiing van een cyclus als een ‘falen om zwanger te ^{worden’43,44}. Dit leidt tot het creëren van ondeugdelijke experimentele praktijken, zoals het weglaten van externe variabelen die hormonale cycli beïnvloeden, het bepalen van start en eindpunten uitsluitend op basis van anatomische ontwikkelingen en het meten van cyclusvoortgang op een lineaire in plaats van circulaire manier. Ondanks de directe correlatie tussen sociaal-culturele factoren en biologische gevolgen, wordt het niet vaak overwogen in de wetenschappelijke literatuur. Door de inspectie van meer holistische publicaties 43,44,45, kunnen onderzoekers deze stigma’s deconstrueren en betrouwbaardere en valide experimentele ontwerpen maken.

Protocol

Alle behandelings- en proceduremethoden die in dit protocol worden beschreven, komen overeen met de richtlijnen voor dierverzorging en -gebruik van de National Institutes of Health (NIH) en zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Pepperdine University en de UCLA Chancellor’s Animal Research Committee (ARC). 1. Verzorging en gebruik van dieren Verkrijg vrouwelijke ratten, in aantallen volgens krachtanalyse, en mannelijke ratten om het Whitten-e…

Representative Results

De huidige gegevens weerspiegelen die van vrouwelijke adolescente SD International Genetic Standardization Program (IGS) in aanwezigheid van mannelijke SD-ratten. Deze dieren werden gelokaliseerd in zowel Pepperdine University als UCLA-laboratoria als onderdeel van een gezamenlijke studie. Figuur 5 toont meerdere variaties van de 4 cyclusfasen. Figuur 5A1 werd geïdentificeerd als een diestrusmonster met verschillende aanwezige celtypen. Dit voo…

Discussion

Belangrijkste stappen en belangrijke overwegingen
Bepaalde kritische stappen in het verstrekte protocol vereisen nadruk, vooral binnen de verzameling vaginale cellen. Tijdens de vaginale vloeistofextractie is het zorgen voor de juiste hoek en diepte van het inbrengen van de spuit de sleutel tot het produceren van bevredigende resultaten en uiteindelijk het voorkomen van irritatie, letsel of cervicale stimulatie van het dier. De stimulatie van de baarmoederhals kan een bron van pseudozwaartekrachtinduc…

Materials

AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera	AmScope	Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5	https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel	Fischer Scientific	14-815-526	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8	NEWCO	93009	https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass	Fischer Scientific	12-553-7A	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses	Fischer Scientific	12-553-464	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fischer Scientific	06-666	https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001	NEWCO Specialty and LabDiet	5012	https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm	Grainger	36UX10	https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9%	Live Action Safety	ABB079830939	https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip – 100 Syringes by BH Supplies	BH Supplies	ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821	https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7& keywords=1ml+sterile+syringe&qid= 1572478649&s=industrial &sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa= ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM 0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja 1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2 xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen	Allentown	LV40326013	https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad	Medline	EAN: 0480196288558  Global Trade Identification Number: 40080196288558	https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853& sr=8-4