Monitoraggio del ciclo estroso dei roditori che utilizza la lavanda vaginale: nessun ciclo normale

Summary

Questo studio descrive in dettaglio i fattori cruciali da considerare nei progetti sperimentali che coinvolgono ratti femmina. In un senso più ampio, questi dati servono a ridurre lo stigma e aiutano nello sviluppo di strumenti diagnostici e di intervento più inclusivi.

Abstract

L’attuale metodologia stabilisce un approccio riproducibile, standardizzato ed economico al monitoraggio del ciclo estrale delle femmine di ratto adolescente Sprague Dawley (SD). Questo studio dimostra la complessità dei cicli ormonali e l’ampio spettro di comprensione necessario per costruire una tecnica di monitoraggio affidabile e valida. Attraverso un esame approfondito dei principali elementi di progettazione sperimentale e procedurali, questa descrizione del ciclo e dei suoi principi fondamentali fornisce un quadro per un’ulteriore comprensione e decostruisce idee sbagliate per la replica futura.

Insieme a uno schema del processo di raccolta dei campioni che impiega la lavanda vaginale, la procedura descrive il meccanismo di categorizzazione dei dati nel modello a quattro stadi di proestro, estro, metestro e diestro. Queste fasi sono caratterizzate da un nuovo approccio proposto, utilizzando i 4 determinanti categorizzanti della condizione del fluido vaginale, del tipo o dei tipi di cellule presenti, della disposizione cellulare e della quantità cellulare al momento della raccolta. Variazioni di ogni fase, campioni favorevoli e sfavorevoli, la distinzione tra ciclicità e aciclicità e rappresentazioni grafiche delle componenti di categorizzazione raccolte sono presentate insieme a pratiche interpretative e organizzative efficaci dei dati. Nel complesso, questi strumenti consentono la pubblicazione di intervalli di dati quantificabili per la prima volta, portando alla standardizzazione dei fattori di categorizzazione al momento della replica.

Introduction

Nuovi contributi
Il ciclo estrale del roditore è stato identificato come un indicatore essenziale di benessere. Tuttavia, i pregiudizi inconsci degli investigatori e le interpretazioni imprecise riguardanti il corpo femminile ostacolano la comunità scientifica. L’etimologia stessa della parola “estrale” implica un senso di inferiorità e negatività. Euripide usò il termine per descrivere una “frenesia” o follia, Omero per descrivere il panico e Platone per descrivere una pulsione irrazionale. Questo studio evidenzia come queste prospettive primordiali influenzino l’attuale comunità scientifica e affronti queste preoccupazioni attraverso un nuovo paradigma a mosaico, una combinazione aggiornata di metodi precedentemente studiati, ampliati nella portata di un approccio più completo.

Lo studio e l’uso di questa tecnica sono necessari, in primo luogo, in quanto non esiste una tecnica di monitoraggio standardizzata e completa e le pratiche di interpretazione dei dati possono essere poco chiare. In secondo luogo, sebbene le caratteristiche del ciclo estrale dipendano dai singoli ratti studiati, sono spesso universalizzate. In terzo luogo, mentre i cicli ormonali sono processi di routine e benefici, sono circondati da uno stigma pericoloso esplorato nella sezione “Traduzione in esseri umani”. Questo studio mira ad affrontare questi tre problemi in tre modi: (A) descrivendo una tecnica di monitoraggio del ciclo estrale approfondito e chiarendo come i risultati possono essere interpretati, (B) delineando metodi che mantengono l’integrità e l’individualità di ciascun ciclo e (C) richiamando l’attenzione su idee sbagliate che perpetuano pratiche non comprovate.

Questo studio è anche unico nel suo focus sui ratti adolescenti, un periodo segnato da cambiamenti cruciali dello sviluppo che fanno luce su varie manifestazioni comportamentali, anatomiche e fisiologiche nell’età adulta¹. Costruire un progetto sperimentale standardizzato per monitorare i cicli ormonali in una popolazione poco studiata mentre decostruisce i pregiudizi comuni consentirà lo sviluppo di correlazioni ormonali affidabili e valide ^2,3,4 e la determinazione delle interruzioni del ciclo dipendenti dalla condizione ^5,6,7,8,9,10 . In definitiva, queste novità servono ad espandere i criteri diagnostici, i trattamenti e gli interventi di vari problemi di benessere.

Definizioni e usi fondamentali
Il ciclo estrale è un insieme di processi fisiologici dinamici che si verificano in risposta ai tre ormoni steroidei sessuali femminili oscillanti: estradiolo, ormone leuteinizzante (LH) e progesterone (Figura 1A, B). Le interazioni tra il sistema endocrino e il sistema nervoso centrale regolano il ciclo, che il più delle volte persiste per 4-5 giorni e si ripresenta dall’inizio della maturazione sessuale fino alla senescenza riproduttiva e/o alla cessazione. È diviso in categorie separate in base ai livelli ormonali, più comunemente nei 4 stadi di diestro (DIE), proestro (PRO), estro (EST) e metestro (MET), che progrediscono in modo circolare. Il numero di divisioni può variare da 3 fasi¹¹ a 13 fasi¹², a seconda della natura dello studio¹³. Il minor numero di divisioni spesso esclude il MET come fase e lo classifica come un periodo di transizione di breve durata. Il numero più alto include tipicamente sottosezioni che consentono un’ispezione più ravvicinata di fenomeni come lo sviluppo tumorale o la pseudogravidanza spontanea, lo stato fisiologico della gravidanza senza impianto embrionale 12,14,15.

In questo studio, le fasi sono state identificate attraverso componenti del canale vaginale, denominati i 3 determinanti di categorizzazione: tipo di cellula presente, disposizione cellulare e quantità cellulare (Figura 2A-D). Mentre la condizione del liquido vaginale non è stata monitorata in questo studio, si raccomanda di includerlo come quarto componente di categorizzazione. Ulteriori informazioni sull’esame del liquido vaginale possono essere trovate nell’elenco di riferimento¹⁶. I componenti di categorizzazione possono essere esaminati estraendo le cellule tramite lavanda vaginale, la tecnica principale raccomandata nel moderno monitoraggio del ciclo estrale. Mentre i processi fisiologici approfonditi all’interno di ogni fase sono al di fuori dello scopo di questo studio, ulteriori informazioni possono essere trovate nella letteratura¹⁷.

L’uso e lo sviluppo continuo di questa tecnica di monitoraggio del ciclo estrale è radicato nelle connessioni tra gli ormoni steroidei sessuali e la funzione dei sistemi corporei come il sistema cardiovascolare¹⁸, il sistema endocrino⁸ e il sistema nervoso centrale 19,20,21. Allo stesso tempo, il monitoraggio del ciclo estrale potrebbe non essere sempre necessario quando sono coinvolte roditori femmine 22,23,24,25. Piuttosto, è importante prima considerare se le differenze di sesso sono state riportate nella specifica area di studio, che può essere ulteriormente esplorata nelle recensioni pubblicate^22,23. Sebbene il monitoraggio del ciclo estrale sia vitale in un ampio spettro di indagini di ricerca, non dovrebbe essere visto come un ostacolo all’inclusione di roditori di sesso femminile negli esperimenti. Mentre questa tecnica può sembrare complessa e dispendiosa in termini di tempo, la procedura stessa può richiedere meno di 15 minuti per essere completata, a seconda dello sperimentatore, ed è conveniente. Nel complesso, l’inclusione di roditori di sesso femminile negli studi scientifici è vantaggiosa per la comprensione dei sistemi corporei, di varie condizioni e patologie e del benessere generale, poiché questi sviluppi si sono basati principalmente sul modello del corpo maschile.

Parametri universali e variabilità naturali nel roditore
Stabilire intervalli per aspetti considerati “tipici” è necessario per definire modelli di ciclo standard, impostare parametri per scopi comparativi e analitici e rilevare anomalie e valori anomali. Allo stesso tempo, è anche importante riconoscere che il ciclo di ogni ratto è unico e sono previste deviazioni basate sul ceppo animale, sui processi fisiologici e sulle condizioni ambientali. In effetti, uno degli aspetti più “normali” del ciclo estrale è la variabilità. Questo si vede nella lunghezza totale del ciclo, con un intervallo di 3-38 giorni^26,27; l’età della maturazione sessuale che può variare da 32-34 giorni a più settimane 28,29,30; ciò che è considerato aciclico¹¹ e i modelli determinanti di categorizzazione^11,13. Nel complesso, non esiste un modello universale per il ciclo estrale e tradurlo sia per la comunità scientifica che per il pubblico in generale è una parte importante del processo sperimentale.

Timepoint sperimentali ed età evolutiva
Riconoscere questo principio di variabilità aiuta a costruire un progetto sperimentale affidabile e valido. Ad esempio, l’inizio del monitoraggio del ciclo estrale si basa sullo sviluppo anatomico e fisiologico dei ratti, che varia in base a fattori ambientali e fisiologici. Il monitoraggio non può iniziare fino allo sviluppo dell’apertura vaginale (VO), che è l’orifizio vaginale esterno circondato dalla vulva che porta alla porzione interna del canale vaginale (Figura 3A-D). Mentre il VO spesso si sviluppa completamente tra i 32 ei 34 giorni di età, rimane individualizzato per ciascun soggetto e molto del processo rimane sconosciuto. Questa apertura è stata utilizzata per identificare l’inizio della maturazione sessuale, che è stata collegata all’aumento dell’estradiolo³¹, alla maturazione dell’asse ipotalamo-ipofisi-ovaio³² e alla prima ovulazione nei ratti 17,33,34,35. Tuttavia, recenti pubblicazioni hanno scoperto che è solo un marcatore indiretto dello sviluppo riproduttivo, in quanto può essere disaccoppiato da eventi ormonali e di sviluppo in ambienti sfavorevoli³¹ e può rappresentare cambiamenti nei livelli di estradiolo piuttosto che la maturazione sessuale³³. Pertanto, si raccomanda di non fare affidamento esclusivamente sul VO per determinare l’età evolutiva e come qualificatore per il monitoraggio del ciclo estrale³⁶, ma di utilizzare anche l’aspetto del primo stadio EST e la cornificazione delle cellule epiteliali³⁰ per segnare l’inizio della maturazione sessuale.

Il peso corporeo è notevolmente correlato all’età evolutiva durante il periodo adolescenziale nei roditori^30,37 e può quindi anche aiutare a determinare l’età evolutiva in questo periodo. I meccanismi proposti relativi a questo fenomeno includono la stimolazione degli ormoni necessari per lo sviluppo riproduttivo, come l’ormone della crescita, e l’inibizione dell’asse ipotalamo-ipofisi surrenale (HPA) da parte del regolatore dell’appetito, la leptina³⁰. Tuttavia, non è consigliabile utilizzare questa misura come unico indicatore dell’età evolutiva a causa della grande varianza osservata tra i ratti tra le specie e i fornitori³⁸. La variabilità osservata nello sviluppo del VO e del peso corporeo esemplifica l’importanza del concetto nel processo sperimentale complessivo.

Traduzione per l’uomo: contesti culturali e scientifici
La relazione traslazionale degli studi riproduttivi tra animali e umani è bidirezionale. I risultati di studi su animali influenzano il modo in cui i processi umani vengono valutati, avvicinati e analizzati³⁹. La percezione del sistema riproduttivo umano e dei suoi processi correlati influenza il modo in cui gli animali vengono studiati. In effetti, una delle indicazioni più forti per ulteriori ricerche in questo settore deriva da credenze socioculturali distorte relative ai cicli ormonali che influenzano il processo scientifico. Molte di queste convenzioni derivano da una generale avversione culturale a discutere delle mestruazioni, che ha portato a una lacuna di dati nella conoscenza ben documentata^40,41. Questo ha uno spettro di conseguenze che vanno da minori a letali: dall’altezza delle scaffalature e dalle dimensioni dello smartphone al montaggio dell’armatura del corpo di polizia e alle mancate diagnosi di cancro⁴².

La descrizione delle mestruazioni come insalubri, distruttive e tossiche – viste in testi venerati, media, dizionari e insegnamenti medici – è conservata da pubblicazioni scientifiche. Ciò avviene attraverso descrizioni imprecise e distorte dei cicli ormonali, l’isolamento del sistema riproduttivo dalle sue controparti neuroendocrine e dalle influenze ambientali, e la prospettiva riduzionista del completamento di un ciclo come un “fallimento nel concepire”^43,44. Ciò porta alla creazione di pratiche sperimentali non sane, come l’omissione di variabili esterne che influenzano i cicli ormonali, la determinazione di inizio e fine basati esclusivamente su sviluppi anatomici e la misurazione dell’avanzamento del ciclo in modo lineare piuttosto che circolare. Nonostante la correlazione diretta tra fattori socioculturali e conseguenze biologiche, non è spesso considerato nella letteratura scientifica. Attraverso l’ispezione di pubblicazioni più olistiche 43,44,45, i ricercatori possono decostruire questi stigmi e creare progetti sperimentali più affidabili e validi.

Protocol

Tutti i metodi di manipolazione e procedura delineati in questo protocollo sono in linea con le linee guida per la cura e l’uso degli animali del National Institutes of Health (NIH) e sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Pepperdine University e dal Comitato per la ricerca sugli animali del Cancelliere dell’UCLA (ARC). 1. Cura e uso degli animali Acquisire ratti femmina, in numero secondo l’analisi di potenza, e ratti maschi per promuover…

Representative Results

I dati attuali riflettono quelli delle femmine adolescenti SD International Genetic Standardization Program (IGS) in presenza di ratti SD maschi. Questi animali sono stati localizzati presso i laboratori della Pepperdine University e dell’UCLA come parte di uno studio collaborativo. La Figura 5 presenta molteplici varianti delle 4 fasi del ciclo. Figura 5A1 è stato identificato come un campione di diestro con diversi tipi di cellule presenti. Q…

Discussion

Passaggi chiave e considerazioni importanti
Alcuni passaggi critici nel protocollo fornito richiedono enfasi, specialmente all’interno della raccolta di cellule vaginali. Durante l’estrazione del liquido vaginale, garantire il corretto angolo e profondità di inserimento della siringa è la chiave per produrre risultati soddisfacenti e, in definitiva, prevenire irritazioni, lesioni o stimolazione cervicale all’animale. La stimolazione della cervice può essere una fonte di induzione della pseudogravid…

Materials

AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera	AmScope	Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5	https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel	Fischer Scientific	14-815-526	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8	NEWCO	93009	https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass	Fischer Scientific	12-553-7A	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses	Fischer Scientific	12-553-464	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fischer Scientific	06-666	https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001	NEWCO Specialty and LabDiet	5012	https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm	Grainger	36UX10	https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC
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