Monitoramento do ciclo estrous de roedores utilizando lavage vaginal: não existe tal coisa como um ciclo normal

Summary

Este estudo detalha os fatores cruciais a serem considerados em projetos experimentais envolvendo ratos fêmeas. Em um sentido maior, esses dados servem para diminuir o estigma e auxiliar no desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico e intervenção mais inclusivas.

Abstract

A metodologia atual estabelece uma abordagem reprodutível, padronizada e econômica para monitorar o ciclo estrous de ratos adolescentes estrous fêmeas Sprague Dawley (SD). Este estudo demonstra a complexidade dos ciclos hormonais e o amplo espectro de compreensão necessário para a construção de uma técnica de monitoramento confiável e válida. Através de um exame aprofundado do desenho experimental principal e dos elementos processuais, esta descrição do ciclo e seus princípios fundamentais fornece um quadro para maior compreensão e desconstrói equívocos para replicação futura.

Juntamente com um esboço do processo de coleta de amostras empregando lavage vaginal, o procedimento descreve o mecanismo de categorização de dados no modelo de quatro estágios de proestrus, estrus, metestrus e diestrus. Essas etapas são caracterizadas por uma nova abordagem proposta, utilizando os 4 determinantes categorizadores da condição de fluido vaginal, tipo celular(s) presente, arranjo celular e quantidade celular no momento da coleta. Variações de cada estágio, amostras favoráveis e desfavoráveis, a distinção entre cíclica e acicllicidade e representações gráficas dos componentes categorizadores coletados são apresentadas juntamente com práticas interpretativas e organizacionais eficazes dos dados. No geral, essas ferramentas permitem a publicação de faixas de dados quantificáveis pela primeira vez, levando à padronização dos fatores de categorização após a replicação.

Introduction

Novas contribuições
O ciclo estrous de roedores tem sido identificado como um indicador essencial de bem-estar. No entanto, vieses inconscientes de investigadores e interpretações imprecisas sobre o corpo feminino dificultam a comunidade científica. A própria etimologia da palavra “estrous” implica um senso de inferioridade e negatividade. Eurípides usou o termo para descrever um “frenesi” ou loucura, Homer para descrever pânico, e Platão para descrever um impulso irracional. Este estudo destaca como essas perspectivas primitivas influenciam a comunidade científica atual e abordam essas preocupações através de um novo paradigma de mosaico — uma combinação atualizada de métodos previamente estudados, expandida em escopo para uma abordagem mais abrangente.

O estudo e o uso dessa técnica são necessários, em primeiro lugar, pois não há técnica de monitoramento padronizada e abrangente, e as práticas de interpretação de dados podem ser pouco claras. Em segundo lugar, embora as características do ciclo estrous dependam da estudo de ratos individuais, elas são muitas vezes universalizadas. Em terceiro lugar, enquanto os ciclos hormonais são processos rotineiros e benéficos, eles são cercados por estigmas perigosos explorados na seção “Tradução para Humanos”. Este estudo tem como objetivo abordar essas três questões de três maneiras — (A) descrevendo uma técnica de monitoramento de ciclo estrous profunda e esclarecendo como os resultados podem ser interpretados, (B) delineando métodos que mantêm a integridade e a individualidade de cada ciclo, e (C) chamando a atenção para equívocos que perpetuam práticas infundadas.

Este estudo também é único em seu foco em ratos adolescentes, período marcado por mudanças cruciais de desenvolvimento que lançam luz sobre diversas manifestações comportamentais, anatômicas e fisiológicas na idade^{adulta 1}. A construção de um projeto experimental padronizado para monitorar ciclos hormonais em uma população sub-pesquisada, ao mesmo tempo em que a desconstrução de vieses comuns permitirá o desenvolvimento de correlações hormonais confiáveis e válidas ^2,3,4 e a determinação de interrupções do ciclo dependentes da condição ^5,6,7,8,9,10 . Em última análise, essas novidades servem para ampliar critérios diagnósticos, tratamentos e intervenções de várias preocupações com o bem-estar.

Definições e usos fundamentais
O ciclo estrous é uma coleção de processos fisiológicos dinâmicos que ocorrem em resposta aos três hormônios esteroides sexuais femininos oscilantes: estradiol, hormônio leuteinizador (LH) e progesterona (Figura 1A,B). As interações entre o sistema nervoso endócrino e central regulam o ciclo, que na maioria das vezes persiste por 4-5 dias e se repete desde o início da maturação sexual até senescência reprodutiva e/ou cessação. Ele é dividido em categorias separadas com base nos níveis hormonais — mais comumente nos 4 estágios de diestrus (DIE), proestrus (PRO), estrus (EST) e metestrus (MET), que progridem de forma circular. O número de divisões pode variar de 3 estágios¹¹ a 13 estágios¹², dependendo da natureza do estudo¹³. O menor número de divisões muitas vezes exclui o MET como um estágio e classifica-o como um período de transição de curta duração. O número maior normalmente inclui subseções que permitem uma inspeção mais aprofundada de fenômenos como desenvolvimento de tumores ou pseudopregnação espontânea, o estado fisiológico da gravidez sem implantação embrionária 12,14,15.

Neste estudo, os estágios foram identificados por meio de componentes do canal vaginal, denominados os 3 classificados de determinantes-células presentes, arranjo celular e quantidade celular (Figura 2A-D). Embora a condição do fluido vaginal não tenha sido monitorada neste estudo, recomenda-se incluí-lo como um quarto componente categorizador. Mais informações sobre o exame do fluido vaginal podem ser encontradas na lista de referência¹⁶. Os componentes categorizadores podem ser examinados extraindo células através de lavagem vaginal, a técnica primária recomendada no monitoramento do ciclo estrous moderno. Embora os processos fisiológicos aprofundados dentro de cada etapa estejam fora do escopo deste estudo, mais informações podem ser encontradas na literatura¹⁷.

O uso e o desenvolvimento contínuo desta técnica de monitoramento de ciclo estrous está enraizado nas conexões entre hormônios esteroides sexuais e a função de sistemas corporais como o sistema cardiovascular¹⁸, sistema endócrino⁸ e sistema nervoso central 19,20,21. Ao mesmo tempo, o monitoramento do ciclo estrous pode nem sempre ser necessário quando os roedores femininos estão envolvidos 22,23,24,25. Em vez disso, é importante primeiro considerar se as diferenças sexuais foram relatadas na área específica do estudo, o que pode ser ainda mais explorado nas revisões publicadas^22,23. Embora o monitoramento do ciclo estrous seja vital em um amplo espectro de investigações de pesquisa, não deve ser visto como um obstáculo para incluir roedores fêmeas em experimentos. Embora essa técnica possa parecer complexa e demorada, o procedimento em si pode levar menos de 15 minutos para ser concluído, dependendo do investigador, e é econômico. No geral, a inclusão de roedores femininos em estudos científicos é vantajosa para a compreensão dos sistemas corporais, das diversas condições e patologias e do bem-estar geral, uma vez que esses desenvolvimentos têm sido baseados principalmente no modelo corporal masculino.

Parâmetros universais e variabilidades naturais no roedor
Estabelecer faixas para aspectos vistos como “típicos” é necessário para definir padrões de ciclo padrão, definir parâmetros para fins comparativos e analíticos e detectar anormalidades e outliers. Ao mesmo tempo, também é importante reconhecer que o ciclo de cada rato é único, e são esperados desvios baseados em cepas animais, processos fisiológicos e condições ambientais. Na verdade, um dos aspectos mais “normais” do ciclo estrous é a variabilidade. Isso é visto no comprimento total do ciclo, com um intervalo de 3-38 dias^26,27; a idade de maturação sexual que pode variar de 32 a 34 dias a várias semanas 28,29,30; o que é considerado acíclico¹¹, e os padrões determinantes categorizadores ^11,13. No geral, não há um modelo universal para o ciclo estrous, e traduzir isso tanto para a comunidade científica quanto para o público em geral é uma parte importante do processo experimental.

Pontos de tempo experimentais e idade do desenvolvimento
Reconhecer esse princípio de variabilidade auxilia na construção de um design experimental confiável e válido. Por exemplo, o início do monitoramento do ciclismo estrous depende do desenvolvimento anatômico e fisiológico dos ratos, que varia de acordo com fatores ambientais e fisiológicos. O monitoramento não pode começar até o desenvolvimento da abertura vaginal (VO), que é o orifício vaginal externo cercado pela vulva que leva à porção interna do canal vaginal (Figura 3A-D). Embora o VO muitas vezes se desenvolva plenamente entre as idades de 32 e 34 dias, ele permanece individualizado para cada sujeito, e muito sobre o processo permanece desconhecido. Esta abertura tem sido utilizada para identificar o início do amadurecimento sexual, que tem sido associado ao aumento do estradiol³¹, ao amadurecimento do eixo hipotalâmica-pituitário-ovário³² e à primeira ovulação em ratos 17,33,34,35. No entanto, publicações recentes descobriram que é apenas um marcador indireto do desenvolvimento reprodutivo, pois pode se desacoplar de ocorrências hormonais e de desenvolvimento em ambientes desfavoráveis³¹ e pode representar mudanças nos níveis estradiol em vez de maturação sexual³³. Portanto, recomenda-se não depender apenas do VO para determinar a idade do desenvolvimento e como qualificação para o monitoramento do ciclo estrous³⁶, mas também utilizar o aparecimento do primeiro estágio EST e a cornificação das células epiteliais³⁰ para marcar o início da maturação sexual.

O peso corporal está notavelmente correlacionado com a idade de desenvolvimento durante o período adolescente em roedores^30,37 e, portanto, também pode auxiliar na determinação da idade do desenvolvimento nesse período. Os mecanismos propostos relacionados a esse fenômeno incluem a estimulação de hormônios necessários para o desenvolvimento reprodutivo, como o hormônio do crescimento, e a inibição do eixo adrenal hipotalâmico-pituitário (HPA) pelo regulador do apetite, a leptina³⁰. No entanto, não é recomendável utilizar essa medida como único indicador da idade do desenvolvimento devido à grande variância observada entre ratos entre espécies e fornecedores de fornecedores³⁸. A variabilidade observada no desenvolvimento do VO e do peso corporal exemplificam a importância do conceito no processo experimental global.

Tradução para humanos: contextos culturais e científicos
A relação translacional dos estudos reprodutivos animal-humano é bidirecional. Os resultados de estudos em animais influenciam a forma como os processos humanos são avaliados, abordados e analisados³⁹. A percepção do sistema reprodutivo humano e seus processos relacionados influenciam a forma como os animais são estudados. De fato, uma das indicações mais altas para novas pesquisas nessa área decorre de crenças socioculturais tendenciosas relacionadas a ciclos hormonais que influenciam o processo científico. Muitas dessas convenções são derivadas de uma aversão cultural geral à discussão da menstruação, o que levou a uma lacuna de dados no conhecimento bem fundamentado^40,41. Isso tem um espectro de consequências que vão de menor a letal — desde altura de prateleira e tamanho do smartphone até a montagem da armadura da polícia e diagnósticos de câncer perdidos⁴².

A descrição da menstruação como insalubre, destrutiva e tóxica — vista em textos reverenciados, mídia, dicionários e ensinamentos médicos — é conservada por publicações científicas. Isso ocorre através de descrições imprecisas e tendenciosas de ciclos hormonais, o isolamento do sistema reprodutivo de suas contrapartes neuroendócrinas e influências ambientais, e a perspectiva reducionista da conclusão de um ciclo como uma “falha na ^{concepção”43,44}. Isso leva à criação de práticas experimentais insalubres, como a omissão de variáveis externas que influenciam os ciclos hormonais, determinando os pontos de partida e os pontos finais baseados apenas em desenvolvimentos anatômicos e medindo o avanço do ciclo de forma linear e não circular. Apesar da correlação direta entre fatores socioculturais e consequências biológicas, muitas vezes não é considerada na literatura científica. Através da inspeção de publicações mais holísticas 43,44,45, os pesquisadores podem desconstruir esses estigmas e criar projetos experimentais mais confiáveis e válidos.

Protocol

Todos os métodos de manuseio e procedimento descritos neste protocolo estão alinhados com as diretrizes de cuidados e uso de animais dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Pepperdine University e pelo Comitê de Pesquisa Animal (ARC) do Chanceler da UCLA. 1. Cuidados e uso de animais Adquirir ratos fêmeas, em números de acordo com a análise de energia, e ratos machos para promover o efeito Whi…

Representative Results

Os dados atuais refletem o do Programa Internacional de Padronização Genética (IGS) da adolescente na presença de ratos SD masculinos. Esses animais foram localizados nos laboratórios pepperdine e ucla como parte de um estudo colaborativo. A Figura 5 apresenta múltiplas variações dos 4 estágios do ciclo. A Figura 5A1 foi identificada como uma amostra de diestrus com vários tipos de células presentes. Este exemplo demonstra que amostra…

Discussion

Principais passos e considerações importantes
Certas etapas críticas no protocolo fornecido requerem ênfase, especialmente dentro da coleta de células vaginais. Durante a extração do fluido vaginal, garantir o ângulo adequado e a profundidade da inserção da seringa é fundamental para produzir resultados satisfatórios e, em última instância, prevenir irritação, lesão ou estimulação cervical ao animal. A estimulação do colo do útero pode ser uma fonte de indução de pseudopregnaç…

Materials

AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera	AmScope	Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5	https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel	Fischer Scientific	14-815-526	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8	NEWCO	93009	https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass	Fischer Scientific	12-553-7A	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses	Fischer Scientific	12-553-464	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fischer Scientific	06-666	https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001	NEWCO Specialty and LabDiet	5012	https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm	Grainger	36UX10	https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC
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