Gnagare Estrous cykelövervakning med vaginal sköljning: Inget sådant som en normal cykel

Summary

Denna studie beskriver de avgörande faktorerna att tänka på i experimentella mönster som involverar honråttor. I en större mening tjänar dessa data till att minska stigmatiseringen och hjälpa till att utveckla mer inkluderande diagnostiska och interventionsverktyg.

Abstract

Den nuvarande metoden etablerar ett reproducerbart, standardiserat och kostnadseffektivt tillvägagångssätt för att övervaka estrouscykeln hos kvinnliga Sprague Dawley (SD) ungdomsråttor. Denna studie visar komplexiteten i hormonella cykler och det breda spektrum av förståelse som krävs för att konstruera en pålitlig och giltig övervakningsteknik. Genom en fördjupad undersökning av huvudsakliga experimentella design- och procedurelement ger denna beskrivning av cykeln och dess grundläggande principer en ram för ytterligare förståelse och dekonstruerar missuppfattningar för framtida replikering.

Tillsammans med en översikt över provinsamlingsprocessen som använder vaginal sköljning beskriver proceduren mekanismen för datakategorisering i fyrstegsmodellen av proestrus, estrus, metestrus och diestrus. Dessa steg kännetecknas av ett nytt föreslaget tillvägagångssätt, som använder de 4 kategoriserande determinanterna för vaginalt vätsketillstånd, närvarande celltyp (er), cellarrangemang och cellkvantitet vid tidpunkten för insamlingen. Variationer av varje steg, gynnsamma och ogynnsamma prover, skillnaden mellan cyklicitet och acyklicitet och grafiska skildringar av de insamlade kategoriseringskomponenterna presenteras tillsammans med effektiva tolknings- och organisatoriska metoder för data. Sammantaget möjliggör dessa verktyg publicering av kvantifierbara dataområden för första gången, vilket leder till standardisering av kategoriseringsfaktorer vid replikering.

Introduction

Nya bidrag
Gnagarens estrouscykel har identifierats som en viktig indikator på välbefinnande. Men omedvetna fördomar hos utredare och felaktiga tolkningar om kvinnokroppen hindrar det vetenskapliga samfundet. Själva etymologin av ordet “estrous” innebär en känsla av underlägsenhet och negativitet. Euripides använde termen för att beskriva en “frenesi” eller galenskap, Homeros för att beskriva panik och Platon för att beskriva en irrationell drivkraft. Denna studie belyser hur dessa urtidsperspektiv påverkar det nuvarande vetenskapliga samfundet och tar itu med dessa problem genom ett nytt mosaikparadigm – en uppdaterad kombination av tidigare studerade metoder, utökad i omfattning för ett mer omfattande tillvägagångssätt.

Studien och användningen av denna teknik är nödvändig, för det första eftersom det inte finns någon standardiserad och omfattande övervakningsteknik, och datatolkningspraxis kan vara oklar. För det andra, även om estrous cykelegenskaper är beroende av att enskilda råttor studeras, är de ofta universaliserade. För det tredje, medan hormonella cykler är rutinmässiga och fördelaktiga processer, är de omgivna av farlig stigma som utforskas i avsnittet “Översättning till människor”. Denna studie syftar till att ta itu med dessa tre frågor på tre sätt – (A) genom att beskriva en djupgående estrous cykelövervakningsteknik och klargöra hur resultaten kan tolkas, (B) genom att beskriva metoder som upprätthåller integriteten och individualiteten i varje cykel och (C) genom att uppmärksamma missuppfattningar som upprätthåller ogrundade metoder.

Denna studie är också unik i sitt fokus på tonårsråttor, en period som präglas av avgörande utvecklingsförändringar som belyser olika beteendemässiga, anatomiska och fysiologiska manifestationer i vuxen ålder¹. Att bygga en standardiserad experimentell design för att övervaka hormonella cykler i en underbeforskad population samtidigt som man dekonstruerar vanliga fördomar kommer att möjliggöra utveckling av tillförlitliga och giltiga hormonella korrelationer ^2,3,4 och bestämning av tillståndsberoende cykelstörningar 5,6,7,8,9,10 . I slutändan tjänar dessa nyheter till att utöka diagnostiska kriterier, behandlingar och interventioner av olika hälsoproblem.

Grundläggande definitioner och användningsområden
Den estrouscykeln är en samling dynamiska fysiologiska processer som uppstår som svar på de tre oscillerande kvinnliga könssteroidhormonerna: östradiol, leuteiniserande hormon (LH) och progesteron (Figur 1A,B). Interaktioner mellan det endokrina och centrala nervsystemet reglerar cykeln, som oftast kvarstår i 4-5 dagar och återkommer från början av sexuell mognad till reproduktiv åldrande och / eller upphörande. Det är indelat i separata kategorier baserat på hormonnivåer – oftast i de 4 stadierna av diestrus (DIE), proestrus (PRO), estrus (EST) och metestrus (MET), som utvecklas på ett cirkulärt sätt. Antalet divisioner kan sträcka sig från 3 steg¹¹ till 13 steg¹², beroende på studiens art¹³. Det lägre antalet divisioner utesluter ofta MET som ett stadium och klassificerar det som en kortvarig övergångsperiod. Det högre antalet innehåller vanligtvis underavsnitt som möjliggör en närmare inspektion av fenomen som tumörutveckling eller spontan pseudograviditet, det fysiologiska tillståndet för graviditet utan embryonal implantation 12,14,15.

I denna studie identifierades stadierna genom komponenter i vaginalkanalen, som heter de 3 kategoriserande determinanterna-celltyperna närvarande, cellarrangemang och cellkvantitet (figur 2A-D). Medan tillståndet för vaginalvätskan inte övervakades i denna studie, rekommenderas det att inkludera det som en fjärde kategoriserande komponent. Mer information om undersökning av vaginalvätskan finns i referenslistan¹⁶. De kategoriserande komponenterna kan undersökas genom att extrahera celler via vaginal sköljning, den primära tekniken som rekommenderas i dagens estrouscykelövervakning. Medan de djupgående fysiologiska processerna inom varje steg ligger utanför ramen för denna studie, kan mer information hittas i litteraturen¹⁷.

Användningen och den fortsatta utvecklingen av denna estrous cykelövervakningsteknik är rotad i kopplingarna mellan könssteroidhormoner och funktionen hos kroppsliga system som hjärt-kärlsystemet¹⁸, endokrina systemet⁸ och centrala nervsystemet 19,20,21. Samtidigt är det inte alltid nödvändigt med övervakning av estrouscykeln när kvinnliga gnagare är inblandade 22,23,24,25. Snarare är det viktigt att först överväga om könsskillnader har rapporterats inom det specifika studieområdet, vilket kan undersökas ytterligare i publicerade recensioner^22,23. Även om estrous cykelövervakning är avgörande i ett brett spektrum av forskningsundersökningar, bör det inte ses som ett hinder för att inkludera kvinnliga gnagare i experiment. Även om denna teknik kan verka komplex och tidskrävande, kan själva proceduren ta mindre än 15 minuter att slutföra, beroende på utredaren, och är kostnadseffektiv. Sammantaget är inkluderingen av kvinnliga gnagare i vetenskapliga studier fördelaktig för förståelsen av kroppssystem, olika tillstånd och patologier och allmänt välbefinnande, eftersom denna utveckling huvudsakligen har baserats på den manliga kroppsmallen.

Universella parametrar och naturliga variationer hos gnagaren
Att fastställa intervall för aspekter som ses som “typiska” är nödvändigt för att definiera standardcykelmönster, ställa in parametrar för jämförande och analytiska ändamål och upptäcka avvikelser och avvikelser. Samtidigt är det också viktigt att inse att varje råttas cykel är unik, och avvikelser baserade på djurstam, fysiologiska processer och miljöförhållanden förväntas. Faktum är att en av de mest “normala” aspekterna av estrouscykeln är variabilitet. Detta ses i den totala cykellängden, med ett intervall på 3-38 dagar^26,27; åldern för sexuell mognad som kan sträcka sig från 32-34 dagar till flera veckor 28,29,30; vad som anses vara^{acykliskt 11}, och de kategoriserande determinantmönstren^11,13. Sammantaget finns det ingen universell mall för estrouscykeln, och att översätta det till både det vetenskapliga samfundet och allmänheten är en viktig del av experimentprocessen.

Experimentella tidpunkter och utvecklingsålder
Att erkänna denna princip om variabilitet hjälper till att bygga en pålitlig och giltig experimentell design. Till exempel är starten av estrous cykelövervakning beroende av råttornas anatomiska och fysiologiska utveckling, som varierar beroende på miljömässiga och fysiologiska faktorer. Övervakningen kan inte börja förrän utvecklingen av vaginalöppningen (VO), som är den yttre vaginala öppningen omgiven av vulva som leder till den inre delen av vaginalkanalen (figur 3A-D). Medan VO ofta utvecklas fullt ut mellan 32 och 34 dagar, förblir den individualiserad för varje ämne, och mycket om processen är fortfarande okänt. Denna öppning har använts för att identifiera uppkomsten av sexuell mognad, som har kopplats till ökningen av östradiol³¹, mognaden av hypotalamus-hypofys-äggstocksaxeln³² och den första ägglossningen hos råttor 17,33,34,35. Nya publikationer har dock funnit att det bara är en indirekt markör för reproduktiv utveckling, eftersom den kan bli frikopplad från hormonella och utvecklingshändelser i ogynnsamma miljöer³¹ och kan representera förändringar i östradiolnivåer snarare än sexuell mognad³³. Därför rekommenderas det att inte förlita sig enbart på VO för att bestämma utvecklingsålder och som en kvalificerare för estrouscykelövervakning³⁶ utan att också använda utseendet på det första EST-steget och kornifiering av epitelcellerna³⁰ för att markera uppkomsten av sexuell mognad.

Kroppsvikt är särskilt korrelerad med utvecklingsålder under tonårsperioden hos gnagare^30,37 och kan därför också hjälpa till att bestämma utvecklingsåldern under denna period. Föreslagna mekanismer relaterade till detta fenomen inkluderar stimulering av hormoner som är nödvändiga för reproduktiv utveckling, såsom tillväxthormon, och hämning av hypotalamus-hypofys binjure (HPA) -axeln av aptitregulatorn, leptin³⁰. Det rekommenderas dock inte att använda detta mått som den enda indikatorn på utvecklingsålder på grund av den stora variationen som ses mellan råttor mellan arter och leverantörsleverantörer³⁸. Variationen som ses i utvecklingen av VO och kroppsvikt exemplifierar konceptets betydelse i den övergripande experimentella processen.

Översättning till människor: kulturella och vetenskapliga sammanhang
Det translationella förhållandet mellan reproduktionsstudier mellan djur och människa är dubbelriktat. Resultaten från djurbaserade studier påverkar hur de mänskliga processerna bedöms, närmar sig och analyseras³⁹. Uppfattningen av det mänskliga reproduktionssystemet och dess relaterade processer påverkar hur djur studeras. Faktum är att en av de högsta indikationerna för vidare forskning på detta område härrör från partiska sociokulturella övertygelser relaterade till hormonella cykler som påverkar den vetenskapliga processen. Många av dessa konventioner härrör från en allmän kulturell aversion mot att diskutera menstruation, vilket har lett till en datalucka i väl underbyggd kunskap^40,41. Detta har ett spektrum av konsekvenser som sträcker sig från mindre till dödliga – från hyllhöjd och smarttelefonstorlek till polisens kroppspansarmontering och missade cancerdiagnoser⁴².

Beskrivningen av menstruation som ohälsosam, destruktiv och giftig – sett i vördade texter, media, ordböcker och medicinska läror – bevaras av vetenskapliga publikationer. Detta sker genom felaktiga och partiska beskrivningar av hormonella cykler, isoleringen av reproduktionssystemet från dess neuroendokrina motsvarigheter och miljöpåverkan och det reduktionistiska perspektivet på slutförandet av en cykel som ett “misslyckande att bli gravid”^43,44. Detta leder till skapandet av osunda experimentella metoder, såsom utelämnande av externa variabler som påverkar hormonella cykler, bestämning av start och slutpunkter baserade enbart på anatomisk utveckling och mätning av cykelframsteg på ett linjärt snarare än cirkulärt sätt. Trots den direkta korrelationen mellan sociokulturella faktorer och biologiska konsekvenser beaktas det inte ofta i vetenskaplig litteratur. Genom inspektion av mer holistiska publikationer 43,44,45 kan forskare dekonstruera dessa stigmas och skapa mer tillförlitliga och giltiga experimentella mönster.

Protocol

Alla hanterings- och procedurmetoder som beskrivs i detta protokoll överensstämmer med National Institutes of Health (NIH) riktlinjer för djurvård och användning och har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Pepperdine University och UCLA Chancellor’s Animal Research Committee (ARC). 1. Djurvård och användning Skaffa honråttor, i antal enligt kraftanalys, och hanråttor för att främja Whitten-effekten eller mer konsekvent cykling<sup class="xr…

Representative Results

De aktuella uppgifterna återspeglar de för kvinnliga ungdomar SD International Genetic Standardization Program (IGS) i närvaro av manliga SD-råttor. Dessa djur var belägna vid både Pepperdine University och UCLA laboratorier som en del av en samarbetsstudie. Figur 5 visar flera variationer av de 4 cykelstegen. Figur 5A1 identifierades som ett diestrusprov med flera celltyper närvarande. Detta exempel visar att prover med ett större antal…

Discussion

Viktiga steg och viktiga överväganden
Vissa kritiska steg i det tillhandahållna protokollet kräver betoning, särskilt inom samlingen av vaginala celler. Under vaginal vätskeutvinning är det viktigt att säkerställa rätt vinkel och djup för sprrutinsättning för att ge tillfredsställande resultat och i slutändan förhindra irritation, skada eller livmoderhalsstimulering till djuret. Stimuleringen av livmoderhalsen kan vara en källa till pseudogravinduktion, indikerad av 12-14 dagar av ett…

Materials

AmScope 40X-1000X LED Student Microscope + 5MP USB Camera	AmScope	Part Number: M150C-E5 EAN: 0608729747796 Model Number: M150C-E5	https://www.amazon.com/AmScope-40X-1000X-Student-Microscope-Camera/dp/B00O9GNOTA/ref=sr_1_15?crid=2W9CHTG8YSOTV& keywords=usb+camera+for+microscope& qid=1572477663&s=industrial &sprefix=USB+camera+for+micr%2Cindustrial%2C177&sr=1-15
BD PrecisionGlide Needle Pack, 20G x 1, Short Bevel	Fischer Scientific	14-815-526	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-precisionglide-single-use-needles-short-bevel-regular-wall-4/14815526#?keyword=BD%20PrecisionGlide%20Needle%20Pack,%2020G%20x%201
Bed O Cob 1/8	NEWCO	93009	https://andersonslabbedding.com/cob-products/bed-ocobs-8b/
Corning™ Plain Microscope Slides Plain water-white glass	Fischer Scientific	12-553-7A	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-plain-microscope-slides-microscope-slides-75-x-25mm/125537a
Corning™ Rectangular Cover Glasses	Fischer Scientific	12-553-464	https://www.fishersci.com/shop/products/corning-square-rectangular-cover-glasses-rectangle-no-1-thickness-0-13-0-17mm-size-24-x-50mm/12553464#?keyword=true
Kimberly-Clark Professional™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fischer Scientific	06-666	https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/p-211240?crossRef=kimwipes
Labdiet Rodent Lab Chow 50lb, 15001	NEWCO Specialty and LabDiet	5012	https://www.labdiet.com/products/standarddiets/rodents/index.html
Linear LED Bulb, UL Type A, T8, Medium Bi-Pin (G13), 4,000 K Color Temperature, Lumens 2550 lm	Grainger	36UX10	https://www.grainger.com/product/36UX10?gclid=CjwKCAjw_ LL2BRAkEiwAv2Y3SW1WdNdkf7 zdIxoT9R6n2DGnrToJHjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRoCi4 cQAvD_BwE&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696 !p!!g!!led18et8%2F4%2F840&ef_id= CjwKCAjw_LL2BRAkEiwAv2Y3SW 1WdNdkf7zdIxoT9R6n2DGnrToJ Hjv-pwCTca4ahQyExrrtWvbgwRo Ci4cQAvD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!335676016696!p!!g!!led18et8%2F4%2F840&cm_mmc= PPC:+Google+PPC
Sodium Chloride Injection Bags, 0.9%	Live Action Safety	ABB079830939	https://www.liveactionsafety.com/injection-iv-solution-9-sodium-chloride-1000ml-bags/
Syringe Sterile 1ml  with Luer Slip Tip – 100 Syringes by BH Supplies	BH Supplies	ASIN: B07BQDRDC2 UPC: 638632928821	https://www.amazon.com/1ml-Syringe-Sterile-Luer-Slip/dp/B07BQDRDC2/ref=sr_1_1_sspa?crid=13S8EGEUK90G7& keywords=1ml+sterile+syringe&qid= 1572478649&s=industrial &sprefix=1+ml+steri%2Cindustrial%2C187&sr=1-1-spons&psc=1&spLa= ZW5jcnlwdGVkUXVhbGlmaWVy PUEyRlo4NFdZWkJLWkxGJm VuY3J5cHRlZElkPUEwMDEzODQ yMjNWNzdWM0hTNzVBRCZlbmNy eXB0ZWRBZElkPUEwNDI3NzAzM 0E5SzVKMkxaQVc2JndpZGdldE5h bWU9c3BfYXRmJmFjdGlvbj1jbGlja 1JlZGlyZWN0JmRvTm90TG9nQ2 xpY2s9dHJ1ZQ==
Wire lids and floors Mouse Maternity Wire Bar LidUsed with Rat Cage (10" X 19" x 8"H )Overall dimen	Allentown	LV40326013	https://www.labx.com/item/wire-lids-and-floors-mouse-maternity-wire-bar-lidused/LV40326013#description
Ultra Lightweight Tissue and Plastic 17' x 24' Disposable Underpad	Medline	EAN: 0480196288558  Global Trade Identification Number: 40080196288558	https://www.amazon.com/Medline-Industries-MSC281224C-Lightweight-Disposable/dp/B00A2G67YU/ref=sr_1_4?keywords=medline+industries+surgical+pads&qid=1572475853& sr=8-4