Summary
Dit proctocol heeft tot doel een methode te bieden voor in vitro en in vivo mitochondriale Ca2+ beeldvorming in astrocyten en neuronen.
Abstract
Mitochondriaal Ca2+ speelt een cruciale rol bij het beheersen van cytosolische Ca2+ buffering, energiemetabolisme en cellulaire signaaltransductie. Overbelasting van mitochondriaal Ca2+ draagt bij aan verschillende pathologische aandoeningen, waaronder neurodegeneratie en apoptotische celdood bij neurologische aandoeningen. Hier presenteren we een celtype specifieke en mitochondria gerichte moleculaire benadering voor mitochondriale Ca2 + beeldvorming in astrocyten en neuronen in vitro en in vivo. We construeerden DNA-plasmiden die coderen voor mitochondria-targeting genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren (GECI's) GCaMP5G of GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) met astrocyten- en neuron-specifieke promotors gfaABC1D en CaMKII en mitochondria-targeting sequence (mito-). Voor in vitro mitochondriale Ca2+ beeldvorming werden de plasmiden getransfecteerd in gekweekte astrocyten en neuronen om GCaMP5G/6s tot expressie te brengen. Voor in vivo mitochondriale Ca2+ beeldvorming werden adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV's) voorbereid en geïnjecteerd in de muizenhersenen om GCaMP5G/6s in mitochondriën in astrocyten en neuronen tot expressie te brengen. Onze aanpak biedt een nuttig middel om mitochondriale Ca2 + -dynamiek in astrocyten en neuronen in beeld te brengen om de relatie tussen cytosolische en mitochondriale Ca2 + -signalering te bestuderen, evenals astrocyten-neuroninteracties.
Introduction
Mitochondriën zijn dynamische subcellulaire organellen en worden beschouwd als de celkrachtcentrales voor energieproductie. Aan de andere kant kunnen mitochondriën Ca2+ opnemen in de matrix als reactie op lokale of cytosolische Ca2+ stijgingen. Mitochondriale Ca2+ opname beïnvloedt de mitochondriale functie, inclusief metabole processen zoals reacties in de tricarbonzuur (TCA) cyclus en oxidatieve fosforylering, en reguleert Ca2+-gevoelige eiwitten onder fysiologische omstandigheden1,2,3,4. Mitochondriale Ca2+ overbelasting is ook een determinant voor celdood, waaronder necrose en apoptose bij verschillende hersenaandoeningen5,6,7. Het veroorzaakt de opening van mitochondriale permeabiliteitstransitieporiën (mPTPs) en de afgifte van caspase-cofactor, die apoptotische celdood initiëren. Daarom is het belangrijk om mitochondriale Ca2 + dynamiek en behandeling in levende cellen te bestuderen om cellulaire fysiologie en pathologie beter te begrijpen.
Mitochondriën handhaven matrix Ca2+ homeostase door een balans tussen Ca2+ opname en efflux. Mitochondriale Ca2+ opname wordt voornamelijk gemedieerd door mitochondriale Ca2+ uniporters (MCU's), terwijl mitochondriale Ca2+ efflux wordt gemedieerd door de Na+-Ca2+-Li+ wisselaars (NCLXs) en de H+/ Ca2+ wisselaars (mHCXs)8. Het evenwicht kan verstoord worden door de stimulatie van G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's)9. Mitochondriale Ca2+ homeostase wordt ook beïnvloed door mitochondriale buffering door de vorming van onoplosbare xCa2+-xPO4x-xOH complexen8.
Intracellulaire en mitochondriale veranderingen in ca2+ concentratie ([Ca2+]) kunnen worden geëvalueerd door fluorescerende of luminescerende Ca2+ indicatoren. Ca2+ binding aan indicatoren veroorzaakt spectrale modificaties, waardoor vrije cellulaire [Ca2+] in real-time in levende cellen kan worden vastgelegd. Er zijn momenteel twee soorten sondes beschikbaar om Ca2+ veranderingen in cellen te monitoren: organische chemische indicatoren en genetisch gecodeerde Ca2+ indicatoren (GECI's). Over het algemeen zijn verschillende varianten met verschillende Ca2+ affiniteiten (gebaseerd op Kd),spectrale eigenschappen (excitatie- en emissiegolflengten), dynamische bereiken en gevoeligheden beschikbaar voor de onderzochte biologische vragen. Hoewel veel synthetische organische Ca2 + -indicatoren zijn gebruikt voor cytosolische Ca2 + -beeldvorming, kunnen slechts een paar selectief worden geladen in de mitochondriale matrix voor mitochondriale Ca2 + -beeldvorming, waarbij Rhod-2 het meest wordt gebruikt (voor beoordelingen zie10,11). Rhod-2 heeft echter een groot nadeel van lekkage tijdens lange tijd-cursus experimenten; bovendien is het verdeeld tussen mitochondriën, andere organellen en het cytosol, waardoor absolute metingen in verschillende subsecties moeilijk zijn. Door gebruik te maken van celtypespecifieke promotors en subcellulaire compartimentgerichte sequenties, kunnen GECI's daarentegen worden uitgedrukt in verschillende celtypen en subcellulaire compartimenten voor cel- en compartimentspecifieke Ca2+ beeldvorming in vitro of in vivo. Op fluorescentie-intensiteit gebaseerde GCaMP Ca2+-indicatoren met één golflengte zijn onlangs naar voren gekomen als belangrijke GECI's12,13,14,15,16. In dit artikel bieden we een protocol voor mitochondria-targeting en celtype specifieke expressie van GCaMP5G en GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) in astrocyten en neuronen, en beeldvorming mitochondriale Ca2 + opname in deze celtypen. Met behulp van dit protocol kan de expressie van GCaMP6G / 6s in individuele mitochondriën worden onthuld en kan Ca2 + opname in enkele mitochondriale resolutie worden bereikt in astrocyten en neuronen in vitro en in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures met betrekking tot dieren zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Missouri-Columbia.
1. Constructie van DNA-plasmiden
OPMERKING: Voor in vitro en in vivo beeldvorming worden DNA-plasmiden geconstrueerd die coderen voor GCaMP5G/6s met astrocyten- en neuronspecifieke promotors en mitochondriale targetingsequenties.
- Mitochondriale matrix (MM)-targeting sequence (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 in de kloonlocaties EcoRI en BamHI in de ruggengraat van adeno-geassocieerd virus (AAV) plasmide pZac2.1 om plasmiden te verkrijgen die astrocytische gfaABC1D-promotor of neuronale CaMKII-promotor18,19,20bevatten.
- Subclone GCaMP5G/6s in de kloonlocaties BamH I en Not 1 in de bovenstaande plasmiden om nieuwe plasmiden pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s en pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s te verkrijgen die zich richten op transgenexpressie in mitochondriën in astrocyten en neuronen20,21 (Figuur 1A).
- Bereid pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G en pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s DNA-plasmiden voor transfectie voor in vitro onderzoek (sectie 2). Produceer AAV-vectoren met serotype 5 voor astrocyten en serotype 9 voor neuronen voor in vivo onderzoek18 (sectie 3).
2. In vitro mitochondriale Ca2+ beeldvorming in astrocyten en neuronen
- Bereid primaire astrocyten uit de cortex van P1 neonatale muizen en primaire neuronen uit de cortex van E15-16 embryo's18,22,23,24en kweek ze op glazen coverslips met een diameter van 12 mm in 24-putplaten met behulp van Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) en neuronaal basaal medium (NBM) met 2% B27, respectievelijk.
- Transfecteer volwassen astrocyten en neuronen met pZac-gfaABC1D-GCaMP6s en pZac-CaMKII-GCaMP5G plasmiden met behulp van lipide gebaseerde transfectie reagens om GCaMP6s tot expressie te brengen in de mitochondriën van astrocyten en GCaMP5G in de mitochondriën van neuronen18,20,21. Transfecteer cellen in elke put met 0,5 μg DNA en verander het medium 6 uur later.
OPMERKING: De astrocyten en neuronen zijn 1-2 dagen na transfectie klaar voor beeldvorming. - Voer in vitro mitochondriale Ca2+ beeldvorming uit 1-2 dagen na transfectie.
- Breng de glazen coverslips gekweekt met astrocyten of neuronen over naar de PH-1 perfusiekamer onder een epifluorescentie of twee fotonenmicroscoop.
- Stimuleer astrocytische mitochondriale Ca2+ opname met 100 μM ATP in ACSF, of stimuleer neuronale mitochondriën met 100 μM glutamaat/10 μM glycine20,25 (Figuur 2 en Figuur 3).
OPMERKING: Oplossingsveranderingen van ACSF naar ATP- en glutamaat/glycine-bevattende ACSF worden geregeld door een ALA-VM8-perfusiesysteem21. De snelheid van de oplossingsverandering wordt geregeld bij 1-2 ml / min door een klep aan te passen.
3. In vivo mitochondriale Ca2+ beeldvorming in astrocyten en neuronen
- AAV voorbereidingen.
- Bereid de volgende recombinante adeno-geassocieerde virus (rAAV) vectoren met behulp van de DNA-plasmiden bereid in sectie 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G en rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vectoren.
OPMERKING: In dit experiment werden rAAV-vectoren van serotype 5 voorbereid om GCaMP5G in mitochondriën in astrocyten tot expressie te brengen en rAAV-vectoren van serotype 9 werden voorbereid om GCaMP6's in mitochondriën in neuronen tot expressie te brengen.
- Bereid de volgende recombinante adeno-geassocieerde virus (rAAV) vectoren met behulp van de DNA-plasmiden bereid in sectie 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G en rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vectoren.
- Stereotaxische AAV injectie.
- Verdoof de muis met 3% isofluraan.
OPMERKING: Later tijdens de operatie worden de isofluraanspiegels verlaagd tot 2%. - Nadat de muis een chirurgisch niveau van anesthesie heeft bereikt, zoals bepaald door staart- en teenknijpen, scheert u het haar over de operatieplaats, motorische of somatosensorische cortex, met een haartrimmer.
- Plaats de muis op het stereotaxische apparaat van de muis en bevestig het hoofd met oorstaven. Breng oogheelkundige zalf aan op de ogen om ze tijdens de operatie te beschermen. Gebruik een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur van de muis gedurende de hele operatie op 37 °C te houden.
OPMERKING: Voer een operatie uit met behulp van aseptische procedures. Alle chirurgische hulpmiddelen moeten worden gesteriliseerd door middel van autoclaveren of een hete kraalsterilisator. - Nadat de muis op het stereotaxische apparaat is gemonteerd, steriliseert u de hoofdhuid drie keer met afwisselend op jodium gebaseerde scrub en 70% ethanol. Maak een incisie in de middellijn van de hoofdhuid om de injectieplaats bloot te leggen.
- Snijd de huid in de bregma-lamda-as open en maak een braamgat met een diameter van ~ 1 mm met een boor met hoge snelheid op de beoogde injectielocatie van de motor of somatosensorische cortex.
- Gebruik een Hamilton-spuit van 33 G met adeno-geassocieerd virus (rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G-vectoren [1 x 1011 GC] of rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vectoren [1 x 1011 GC]) om tot 1 μL virus in het doelgebied te injecteren.
OPMERKING: Injecteer bijvoorbeeld voor corticale virale toediening de virusoplossing op twee diepten in meerdere stappen. Breng eerst de naald in op een diepte van 1 mm van de dura en laat 5 minuten intrekken voordat de hersenen zich herstellen. Beweeg vervolgens de naald tot ~ 700 μm diepte en injecteer 500 nL van de virusoplossing met een injectiesnelheid van 10 nL / s met behulp van een hamiltonspuit die wordt bestuurd door een microsyringe pompregelaar. Nadat de injectie is voltooid, wacht u 5 minuten om het virus in de hersenen te laten diffunderen. Verplaats vervolgens de naald naar de tweede injectieplaats op een diepte van 300 μm. Injecteer hier nog eens 500 nL van de virusoplossing. Wacht 10 minuten om het virus in de hersenen te laten diffunderen. - Sluit de hoofdhuid en de huid met een weefsellijm. Laat de muizen herstellen op het verwarmingskussen. Stuur muizen na herstel terug naar de dierenfaciliteit.
- Verdoof de muis met 3% isofluraan.
- Cranial-window intstallatie en in vivo twee-foton (2-P) beeldvorming van mitochondriale Ca2+ signalen.
OPMERKING: Craniale vensterimplantatie wordt 3 weken na AAV-injectie over de motorische of somatosensorische cortex26,27,28,29 gedaan. Carprofen (10 mg/kg) wordt subcutaan geïnjecteerd om verlichting te bieden van mogelijke pijn vóór de operatie. De craniale raamchirurgische procedures zijn identiek aan de AAV-injectiechirurgische procedures en worden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden.- Verdoof de muis met 3% isofluraan.
OPMERKING: Dit is de aanvangsdosis en verlaag tot 2% voor de operatie later. Tijdens de beeldvorming wordt een intraperitoneale (IP) injectie van 130 mg ketamine/10 mg xylazine/kg lichaamsgewicht opgelost in ACSF gebruikt voor anesthesie. - Plaats de muis op het stereotaxische apparaat van de muis en bevestig het hoofd met oorstaven. Breng oogheelkundige zalf aan op de ogen. Gebruik een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur van de muis gedurende de hele operatie op 37 °C te houden.
OPMERKING: Alle chirurgische hulpmiddelen moeten worden gesteriliseerd. - Maak een incisie van 5-8 mm lang in de middellijn van de hoofdhuid en verwijder een flap van de huid met een schaar.
- Nadat de schedel is blootgesteld, voert u craniotomie met een diameter van 2,0-3,0 mm uit met behulp van een snelle boor over het door het virus geïnjecteerde gebied (d.w.z. motorische cortex of somatosensorische cortex, figuur 1B). Maak eerst vier kleine gaatjes en boor dan mee in een cirkel die de gaten met elkaar verbindt. Til vervolgens het bot op en verwijder het met een scherpe schaar en verwijder het. De blootgestelde dura mater kan worden verwijderd of intact worden gehouden voor impantatie van het schedelraam.
- Plaats een glazen afdekplaat met een diameter van 3-5 mm met een transparante siliconen over de craniotomie. Gebruik een tandenstoker om het schedelraam zachtjes op het oppervlak van de hersenen te duwen. Sluit vervolgens de rand af met een kleine hoeveelheid siliconenlijm.
OPMERKINGEN: Als alternatief kan in plaats van siliconenschijf 1,2% agarose-gel met een laag smeltpunt worden gebruikt tussen het dekglas en het hersenweefsel. - Sluit ten slotte de randen van de afdekplaat af met tandcement. Zorg ervoor dat u het cement iets aanbrengt aan de rand van het schedelraam voor een sterke hechting. Bevestig een op maat gemaakte metalen kopplaat aan de schedel met tandcement.
OPMERKING: De metalen plaat wordt gebruikt om de kop van de muis tijdens de beeldvormingssessie in het stadium van de 2-P-microscoop te bevestigen(figuur 1C). - Voeg 0,5 ml ACSF-oplossing toe over de coverslip op het schedelvenster voor onderdompeling in water tijdens het afbeelden.
- Time-lapse in vivo 2-P beeldvorming van mito-GCaMP5G in astrocyten en mito-GCaMP6s uitvoeren in neuronen met een golflengte van 910 nm door het schedelvenster(Figuur 1C)18,20,27.
OPMERKING: Tijdens het afbeelden zitten muizen op het verwarmingskussen om de fysiologische temperatuur te handhaven. De muizen worden onmiddellijk na afloop van de beeldvormingssessie opgeofferd. - Label astrocyten in vivo met sulforhodamine 101 (SR101) wanneer het nodig is om colocalisatie te bepalen.
- Breng aan het einde van stap 3.3.4 gedurende 1-5 minuten 100 μL 100 μM SR101 in ACSF aan op het corticale oppervlak.
- Spoel het oppervlak af met ACSF om de ongebonden SR101 weg te spoelen. Met behulp van 2-P beeldvorming kan co-labeling van mito-GCaMP5G en SR101 in astrocyten 45-60 minuten later worden waargenomen(Figuur 4A).
- Verdoof de muis met 3% isofluraan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van deze studie was om een methodologie te bieden om mitochondriale Ca2 + -signalen in beeld te brengen met behulp van GECI's in astrocyten en neuronen in vitro en in vivo. Resultaten van zowel in vitro als in vivo mitochondriale Ca2+ beeldvorming worden hier gepresenteerd.
In vitro mitochondriale Ca2+ signalering in gekweekte astrocyten en neuronen
Mitochondriale Ca2+ opname in astrocyten kan worden opgewekt door ATP-toepassing, en mitochondriale Ca2+ opname in neuronen kan worden opgewekt door glutamaat en glycine toepassing via een perfusiesysteem. Figuur 2 en figuur 3 laten zien dat GCaMP6s wordt uitgedrukt in respectievelijk gekweekte astrocyten en GCaMP5G in neuronen. Mitochondriale Ca2+ opname in astrocyten werd opgewekt door 100 μM ATP met enkele mitochondriale resolutie(Figuur 2B-D). Mitochondriale Ca2+ opname in neuronen werd opgewekt door 100 μM glutamaat en 10 μM glycine met enkelvoudige mitochondriale resolutie(Figuur 3B-D).
In vivo 2-P beeldvorming van mitochondriale expressie van GCaMP5G of 6S in astrocyten en neuronen
De beeldvorming wordt gedaan door time-lapse in vivo 2-P beeldvorming van mitochondriale fluorescentiesignalen in astrocyten en neuronen te verzamelen met een Ultima 2-P microscoopsysteem. We gebruiken excitatiegolflengte 880-910 nm. Figuur 4 toont de expressie van GCaMP5G in mitochondriën in astrocyten in de cortex van de muis. De astrocytenspecifieke expressie van GCaMP5G werd bevestigd door colocalisatie van SR101 met GCaMP5G met enkele mitochondriale resolutie(figuur 4A)en spontane Ca2+ veranderingen in individuele mitochondriën kunnen worden waargenomen(Figuur 4B-E). Figuur 5A toont neuron-specifieke expressie van mito-GCaMP6's gecolokaliseerd met neuronale marker NeuN. De fluorescentie van mito-GCaMP6's in neuronen toont mitochondriale morfologie in dendrieten (Figuur 5B). Spontane mitochondriale Ca2+ toename van dendrieten kan worden waargenomen (Figuur 5C-F).
Analyse van mitochondriale Ca2+ signalen
Kwantificeer de fluorescerende signalen door de gemiddelde pixelintensiteiten van het cellichaam of individuele mitochondriën in astrocyten en neuronen te berekenen met behulp van beeldanalysesoftware. Ca2+ veranderingen overuren (t) worden uitgedrukt als F/Fo (t) waarden versus tijd, waarbij Fo de achtergrond afgetrokken baseline fluorescentie is en F de baseline afgetrokken fluorescentie verandering20,21. Gebruik de piek F/Fo-waarden om de amplitude van Ca2+ signalen te vergelijken.
Figuur 1: DNA-constructies voor astrocyten- en neuronspecifieke mitochondria-gerichte transgenexpressie, en in vivo 2-P beeldvorming. (A) DNA-constructies van genetisch gecodeerde Ca2+ indicator GCaMP5G of GcaMP6s in pZac2.1 plasmide met gfaABC1D (up) en CaMKII (lage) promotors voor levering aan respectievelijk de astrocytische en neuronale mitochondriale matrix. Mitochondria-targeting wordt bereikt met behulp van een mitochondriale matrix (MM) specifieke sequentie (mito) toegevoegd aan de N-terminus van de fluorescerende eiwitten. (B) Een craniotomie over de cortex van een muis. (C) De schedel van een muis is bevestigd aan een metalen plaat die is verbonden met de paal die op het podium van de 2-P microscoop is bevestigd. De inzet toont het schedelraam met een metalen plaat bevestigd aan de schedel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Mitochondriale Ca2+ beeldvorming van gekweekte astrocyten. (A-B) Een 2-P afbeelding van een astrocyte die mito-GCaMP6s (A) tot expressie brengt en zijn reactie op de stimulatie van 100 μM ATP op het aangegeven tijdstip (B). (C) Beelden van mito-GCaMP6's in de vier individuele mitochondriën (in A, cirkels) op de verschillende tijdstippen na ATP-stimulatie. DDe tijdsverloop van mito-GCaMP6s fluorescentie verandert, uitgezet als ΔF/Fo, in de vier individuele mitochondriën na ATP-stimulatie. De rode pijl geeft de begintijd van de beeldvorming aan. De pseudokleurschaal is een lineaire weergave van de fluorescentie-intensiteit in deze en andere figuren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Mitochondriale Ca2+ beeldvorming van gekweekte neuronen. (A-B) Een 2-P-beeld van mito-GCaMP5G dat neuron (A) tot expressie brengt en de respons op 100 μM glutamaat en 10 μM glycine op het aangegeven tijdstip (B). (C) Beelden van mito-GCaMP5G in de vier individuele mitochondriën (in A, cirkels) op verschillende tijdstippen na glutamaatstimulatie. DDe tijdsverloop van mito-GCaMP5G fluorescentie verandert in de vier individuele mitochondriën. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: In vivo 2-P beeldvorming van mitochondriale Ca2+ signalering in astrocyten. (A) 2-P beelden van mito-GCaMP5G die astrocyten tot expressie brengen die gecolokaliseerd zijn met SR101. (B-C) 2-P afbeelding van een astrocyte die mito-GCaMP5G tot expressie brengt voor analyse van spontane Ca2+ toename. (C-E) Beelden van mito-GCaMP5G in de vier individuele mitochondriën in de astrocyte (in B, cirkels) op de verschillende tijdstippen (C) en de tijdsverloop van mito-GCaMP5G fluorescentieveranderingen, uitgezet als ΔF/Fo, in de vier individuele mitochondriën (E). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: In vivo 2-P beeldvorming van mitochondriale Ca2+ signalering in neuronen. (A) Colocalisatie van GCaMP6s (boven) met neuronale marker NeuN (midden) in de hersenen. (B) Hoge resolutie beelden van dendrieten die GCaMP6s uitdrukken met mitochondriale morfologie (aangegeven door *s). (C)GCaMP6s uitgedrukt in neuronale mitochondriën. (D-F) Analyse van spontane mitochondriale Ca2+ toename van neuronen. Pseudocolor 2-P beeld van de mitochondriën die mito-GCaMP6s in C op verschillende tijdstippen ( D ) tot expressiebrengen. Beelden van mito-GCaMP6's in de vier individuele mitochondriën in C (cirkels) op de verschillende tijdstippen (E-F) en de tijdsverloop van mito-GCaMP6s fluorescentieveranderingen, uitgezet als ΔF / Fo, in de vier individuele mitochondriën (F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film: Mitochondriale Ca2+ verhoogt op basis van GCaMP5G fluorescentieveranderingen in reactie op 100 μM ATP in gekweekte astrocyten. Klik hier om deze film te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel bieden we een methode en protocol voor het afbeelden van mitochondriale Ca2+ signalen in astrocyten en neuronen. We implementeerden mitochondria-targeting en celtype-specifieke strategieën om GECI GCaMP5G/6s tot expressie te brengen. Om GCaMP5G/6s in mitochondriën aan te pakken, hebben we een mitochondria-targeting sequentie in de plasmiden opgenomen. Om GCaMP5G/6s in vivoin astrocyten en neuronen tot expressie te brengen, hebben we een astrocytenspecifieke promotor gfaABC1D en neuronspecifieke promotor CaMKII in de plasmiden ingebracht. Celtype specifieke expressie van GCaMP5G/6s in astrocyten en neuronen kan worden bevestigd door SR101-labeling in astrocyten en immunostaining van neuronen met NeuN. Uit onze gegevens blijkt dat deze strategieën een betrouwbare celtypespecifieke benadering bieden voor mitochondriale Ca2 + beeldvorming in astrocyten en neuronen in vivo.
Een potentieel probleem voor GECI-expressie is dat het Ca2+ buffering kan veroorzaken, omdat het vrije Ca2+ door Ca2+ binding kan verminderen. Een ander probleem waar aandacht aan besteed kan worden is de hoeveelheid virus die wordt geïnjecteerd. Individuele cellen die GECI tot expressie brengen, kunnen niet worden geïdentificeerd als een overmatig virus wordt geïnjecteerd. Deze problemen kunnen effectief worden verholpen door de titer van AAV te verminderen. Fotobleaching kan ook een probleem zijn. Theoretisch zijn alle fluorescerende indicatoren onderhevig aan fotobleaching. GCaMP5G / 6s zijn vrij stabiel, maar ze zullen bleken bij voortdurende blootstelling aan excitatielicht. Een algemene praktijk om fotobleaching te voorkomen, is om de blootstellingstijd van weefsel aan laserlicht te verkorten en ervoor te zorgen dat voldoende fluorescentie wordt verzameld. Dit kan worden bereikt als pmt's met een hoge gevoeligheid en hoge lichttransmissiedoelstellingen worden gebruikt. Fotobleaching kan ook worden verminderd door de sluiter tussen de afbeeldingen te sluiten.
In onze resultaten van in vivo 2-P beeldvorming kunnen spontane mitochondriale verhogingen worden waargenomen, zowel in astrocyten als in neuronen. Met name deze mitochondriale Ca2+ transiënten hebben een lange duur (Figuur 4E en Figuur 5E), in overeenstemming met een recent rapport van Gobel et al.30. Het onderliggende mechanisme van dit fenomeen is niet duidelijk, maar het is de moeite waard om verder te worden onderzocht. Voor cytosolische Ca2+ toename hebben astrocyten en neuronen verschillende mechanismen. G-eiwitreceptorstimulaties veroorzaken Ca2 + toename van ER in astrocyten, terwijl de activeringen van voltage gated Ca2 + kanalen of glutamaatreceptoren cytosolische Ca2 + toename van neuronen veroorzaken, die kunnen worden opgenomen door mitochondriën. In onze vorige studie20vonden we dat wanneer mito-GCaMP5G werd gecotransfecteerd met IP3 5-fosfatase (5ppase) gekweekte astrocyten, ATP-geïnduceerde mitochondriale Ca2 + toename grotendeels kon worden afgeschaft. De twee mutanten van 5ppase, d.w.z. R343A en R343A/R350A 5ppase, die geen enzymatische activiteit hebben, hadden echter geen invloed op de mitochondriale Ca2+ toename na ATP-stimulatie. Deze resultaten geven aan dat cytosolische en mitochondriale Ca2 + niveaus sterk gekoppeld zijn, waarschijnlijk vanwege de intieme fysieke verbinding tussen de ER en mitochondriën in astrocyten, waarbij het cytosol dient als een intermediair kanaal voor Ca2 + levering. We ontdekten ook dat glutamaatstimulatie mitochondriale Ca2 + toename in neuronen veroorzaakte, wat suggereert dat glutamaatreceptoren een rol spelen bij Ca2 + -toegang vanuit extracellulaire ruimte. In de toekomst zal het interessant zijn om sensorisch gedreven mitochondriale Ca2+ verhogingen van astrocyten en neuronen te bestuderen.
Onze aanpak kan worden gebruikt om cytosolische en mitochondriale Ca2+ signalen in hetzelfde celtype in beeld te brengen wanneer twee GECI's van verschillende fluorescentiegolflengten worden uitgedrukt, bijvoorbeeld een rode florescentie GECI RCaMP in cytoplasma en GCaMP in mitochondriën, of omgekeerd31. Deze benadering kan ook worden gebruikt voor de in vivo studie van astrocyten-neuron interacties in fysiologie en pathologie met GCaMP uitgedrukt in astrocyten en RCaMP in neuronen, of vice versa.
GCaMP is een GFP-gebaseerde single golflengte fluorofoor GECI. Momenteel zijn GCaMP's de meest geprefereerde Ca2+ indicatoren vanwege hun hoge signaal-ruisverhouding (SNR) en grote dynamische bereiken (DR). Onlangs werden jGCaMP7-sensoren, de geoptimaliseerde versie van GCaMP6, gemeld met verbeterde gevoeligheid voor individuele pieken16. GCaMP7-sensoren kunnen eenvoudig worden ondergesloten in onze plasmiden voor mitochondriale Ca2 + beeldvorming. Samenvattend kunnen de strategieën die we hier hebben gepresenteerd worden gebruikt om mitochondriale Ca2+ opname en behandeling in neuronen en astrocyten in beeld te brengen met voldoende gevoeligheid om Ca2+ veranderingen op single mitochondriaal niveau in vivoop te lossen. Dit protocol is een nuttig middel om cytosolische en mitochondriale Ca2 + signalering in astrocyten en neuronen te bestuderen, evenals astrocyte-neuron interacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) verleent R01NS069726 en R01NS094539 aan SD. Wij danken Erica DeMers voor de audio-opname.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
References
- Griffiths, E. J., Rutter, G. A. Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Llorente-Folch, I., et al. Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons. The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).
- Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes. The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).
- Duchen, M. Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).
- Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons. Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).
- Qiu, J., et al. Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals. Nature Communications. 4, 2034 (2013).
- Filadi, R., Greotti, E. The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology. Cell Calcium. 93, 102321 (2021).
- Finkel, T., et al. The ins and outs of mitochondrial calcium. Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T.
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Yamada, Y., et al. Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).
- Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction. Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).
- Lee, Y., et al. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
- Li, H., et al. Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store. Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).
- Zhang, N., Ding, S. Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).
- Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models. Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).
- Wang, X., Li, H., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia. Scientific Reports. 6, 32416 (2016).
- Wang, X., et al. Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury. Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).
- Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).
- Ding, S. In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes. Milner, R. , Humana Press. 545-554 (2012).
- Li, H., et al. Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke. Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).
- Ding, S., et al. Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo. Glia. 57 (7), 767-776 (2009).
- Ding, S., et al. Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).
- Gobel, J., et al. Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling. Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle. eLife. 10, 64821 (2021).
