Imagem Mitocondrial Ca2+ Absorção em Astrócitos e Neurônios usando Indicadores Ca2+ Codificados Geneticamente (GECIs)
Summary
Este proctocol tem como objetivo fornecer um método para imagens in vitro e in vivo mitocondrial Ca2+ em astrócitos e neurônios.
Abstract
Mitocondrial Ca2+ desempenha um papel crítico no controle do tampão citosolico Ca2+, metabolismo energético e transdução de sinal celular. A sobrecarga do Ca2+ mitocondrial contribui para várias condições patológicas, incluindo neurodegeneração e morte celular apoptótica em doenças neurológicas. Aqui apresentamos um tipo celular específico e mitocôndrias visando abordagem molecular para imagem mitocondrial Ca2+ em astrócitos e neurônios in vitro e in vivo. Construímos plasmídeos de DNA codificando mitocôndrias com alvo genético de indicadores Ca2+ codificados geneticamente (GECIs) GCaMP5G ou GCaMP6s (GCaMP5G/6s) com promotores específicos de astrócitos e neurônios gfaABC1D e CaMKII e sequência de alvo de mitocôndrias (mito-). Para imagens mitocondriais in vitro Ca2+, os plasmídeos foram transfectados em astrócitos e neurônios cultivados para expressar GCaMP5G/6s. Para imagens in vivo mitocondrial Ca2+, vetores virais associados a Adeno (AAVs) foram preparados e injetados nos cérebros do camundongo para expressar GCaMP5G/6s em mitocôndrias em astrócitos e neurônios. Nossa abordagem fornece um meio útil para a imagem mitocondrial Ca2+ dinâmica em astrócitos e neurônios para estudar a relação entre a sinalização citosolic e mitocondrial Ca2+, bem como interações astrócito-neurônio.
Introduction
Mitocôndrias são organelas subcelulares dinâmicas e são consideradas como potências celulares para produção de energia. Por outro lado, as mitocôndrias podem levar o Ca2+ à matriz em resposta aos aumentos locais ou citosóicos ca2+. A absorção mitocondrial Ca2+ afeta a função mitocondrial, incluindo processos metabólicos como reações no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e fosforilação oxidativa, e regula as proteínas sensíveis ca2+em condições fisiológicas1,2,3,4. A sobrecarga mitocondrial Ca2+ também é determinante para a morte celular, incluindo necrose e apoptose em vários distúrbios cerebrais5,6,7. Causa a abertura de poros de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTPs) e a liberação do cofator caspase, que iniciam a morte celular apoptótica. Por isso, é importante estudar melhor a dinâmica mitocondrial ca2+ e o manuseio em células vivas para entender melhor a fisiologia celular e a patologia.
Mitocôndrias mantêm a matriz Ca2+ homeostase através de um equilíbrio entre a absorção de Ca2+ e o efflux. A captação mitocondrial Ca2+ é mediada principalmente por semportadores mitocondriais Ca2+ (MCUs), enquanto o efflux Mitocondrial Ca2+ é mediado pelos trocadores Na+-Ca2+-Li+ (NCLXs) e pelos trocadores H+/Ca2+ (mHCXs)8. O equilíbrio pode ser perturbado através da estimulação de receptores acoplados de proteína G (GPCRs)9. Mitocondrial Ca2+ homeostasis também é afetada pelo tampão mitocondrial pela formação de complexos insolúveis xCa2+-xPO4x-xOH8.
Alterações intracelulares e mitocondriais na concentração de Ca2+ ([Ca2+]) podem ser avaliadas por indicadores fluorescentes ou luminescentes Ca2+. A vinculação ca2+ aos indicadores causa modificações espectrais, permitindo o registro de celular gratuito [Ca2+] em tempo real em células ao vivo. Atualmente, dois tipos de sondas estão disponíveis para monitorar as alterações do Ca2+nas células: indicadores químicos orgânicos e indicadores ca2+ (GECIs) codificados geneticamente. Geralmente, diferentes variantes com diferentes afinidades ca2+ (baseadas em Kd),propriedades espectrais (comprimentos de onda de excitação e emissão), faixas dinâmicas e sensibilidades estão disponíveis para as questões biológicas sob investigação. Embora muitos indicadores orgânicos sintéticos Ca2+ tenham sido utilizados para imagens citosócidas Ca2+, apenas alguns podem ser carregados seletivamente na matriz mitocondrial para imagem mitocondrial Ca2+, sendo Rhod-2 o mais utilizado (para revisões ver10,11). No entanto, o Rhod-2 tem uma grande desvantagem de vazamento durante experimentos de longo curso; além disso, é particionada entre mitocôndrias, outras organelas e o citosol, dificultando as medições absolutas em diferentes subcomentamentos. Em contraste, usando promotores específicos do tipo celular e sequências de segmentação de compartimentos subcelulares, os GECIs podem ser expressos em diferentes tipos de células e compartimentos subcelulares para imagens Ca2+ específicas para células e compartimentos in vitro ou in vivo. Os indicadores GCaMP Ca2+ baseados em intensidade de comprimento único surgiram recentemente como principais GECIs12,13,14,15,16. Neste artigo, fornecemos um protocolo para a segmentação de mitocôndrias e expressão específica do tipo celular de GCaMP5G e GCaMP6s (GCaMP5G/6s) em astrócitos e neurônios, e a absorção mitocondrial ca2+ de imagem nesses tipos de células. Usando este protocolo, a expressão de GCaMP6G/6s em mitocôndrias individuais pode ser revelada, e a absorção do Ca2+ em resolução mitocondrial única pode ser alcançada em astrócitos e neurônios in vitro e in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, fornecemos um método e protocolo para imagens mitocondrial Ca2+ sinais em astrócitos e neurônios. Implementamos estratégias específicas de segmentação de mitocôndrias e tipo celular para expressar GECI GCaMP5G/6s. Para atingir GCaMP5G/6s em mitocôndrias, incluímos uma sequência de metas de mitocôndrias nos plasmídeos. Para expressar GCaMP5G/6s em astrócitos e neurônios in vivo,inserimos um promotor específico de astrócito gfaABC1D e promotor específico de neurônios CaM…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde de Distúrbios Neurológicos e AVC (NINDS) concede R01NS069726 e R01NS094539 à SD. Agradecemos a Erica DeMers pela gravação de áudio.
Materials
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
References
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