Imaging Dell'assorbimento mitocondriale di Ca2+ in astrociti e neuroni utilizzando indicatori Ca2+ geneticamente codificati (GECI)

Summary

Questo proctocollo mira a fornire un metodo per l’imaging mitocondriale In vitro e in vivo Ca²⁺ in astrociti e neuroni.

Abstract

Il Ca²⁺ mitocondriale svolge un ruolo fondamentale nel controllo del buffering citosolico di Ca^2+, del metabolismo energetico e della trasduzione del segnale cellulare. Il sovraccarico di Ca²⁺ mitocondriale contribuisce a varie condizioni patologiche, tra cui la neurodegenerazione e la morte cellulare apoptotica nelle malattie neurologiche. Qui presentiamo un approccio molecolare specifico per tipo cellulare e mitocondri per l’imaging mitocondriale Ca²⁺ in astrociti e neuroni in vitro e in vivo. Abbiamo costruito plasmidi di DNA che codificano gli indicatori Ca²⁺ geneticamente codificati (GECI) GCaMP5G o GCaMP6s (GCaMP5G/6s) con promotori astrociti e neuronali specifici gfaABC1D e CaMKII e sequenza di targeting dei mitocondri (mito-). Per l’imaging mitocondriale in vitro Di Ca^2+, i plasmidi sono stati trasfettati in astrociti e neuroni in coltura per esprimere GCaMP5G/6s. Per l’imaging mitocondriale in vivo di Ca^2+, sono stati preparati vettori virali adeno-associati (AAV) e iniettati nel cervello del topo per esprimere GCaMP5G/6s nei mitocondri negli astrociti e nei neuroni. Il nostro approccio fornisce un mezzo utile per visualizzare la dinamica mitocondriale Ca²⁺ in astrociti e neuroni per studiare la relazione tra segnalazione citosolica e mitocondriale Ca^2+, così come le interazioni astrociti-neuroni.

Introduction

I mitocondri sono organelli subcellulari dinamici e sono considerati le centrali cellulari per la produzione di energia. D’altra parte, i mitocondri possono assorbire Ca²⁺ alla matrice in risposta a aumenti locali o citosolici di Ca^2+. L’assorbimento mitocondriale di Ca²⁺ influenza la funzione mitocondriale, compresi i processi metabolici come le reazioni nel ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA) e la fosforilazione ossidativa, e regola le proteine sensibili al Ca²⁺in condizioni fisiologiche^1,2,3,4. Il sovraccarico mitocondriale di Ca²⁺ è anche un fattore determinante per la morte cellulare, compresa la necrosi e l’apoptosi in vari disturbi cerebrali^5,6,7. Provoca l’apertura dei pori di transizione della permeabilità mitocondriale (mPTPs) e il rilascio di cofattore caspasi, che avvia la morte cellulare apoptotica. Pertanto, è importante studiare la dinamica e la manipolazione mitocondriale di Ca²⁺ nelle cellule viventi per comprendere meglio la fisiologia e la patologia cellulare.

I mitocondri mantengono l’omeostasi della matrice Ca²⁺ attraverso un equilibrio tra l’assorbimento di Ca²⁺ e l’efflusso. L’assorbimento mitocondriale di Ca²⁺ è mediato principalmente dagli uniportatori mitocondriali Di Ca²⁺ (MCU), mentre l’efflusso mitocondriale di Ca²⁺ è mediato dagli scambiatori Na⁺-Ca²⁺-Li⁺ (NCLX) e dagli scambiatori H⁺/Ca²⁺ (mHCX)⁸. L’equilibrio può essere perturbato attraverso la stimolazione dei recettori accoppiati alla proteina G (GPCR)⁹. L’omeostasi mitocondriale di Ca²⁺ è anche influenzata dal tamponamento mitocondriale dalla formazione di complessi insolubili xCa²⁺-xPO₄x-xOH⁸.

Le variazioni intracellulari e mitocondriali della concentrazione di Ca²⁺ ([Ca^2+])possono essere valutate mediante indicatori fluorescenti o luminescenti di Ca^2+. Il legame di Ca²⁺ agli indicatori provoca modifiche spettrali, consentendo la registrazione di cellule libere [Ca^2+]in tempo reale in cellule vive. Attualmente sono disponibili due tipi di sonde per monitorare i cambiamenti di Ca²⁺ nelle cellule: indicatori chimici organici e indicatori Ca²⁺ geneticamente codificati (GECI). Generalmente, diverse varianti con diverse affinità di Ca²⁺ (basate su K_d),proprietà spettrali (lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione), intervalli dinamici e sensibilità sono disponibili per le questioni biologiche in esame. Sebbene molti indicatori organici sintetici di Ca²⁺ siano stati utilizzati per l’imaging citosolico di Ca^2+, solo pochi possono essere caricati selettivamente nella matrice mitocondriale per l’imaging mitocondriale Ca^2+, con Rhod-2 che è il più utilizzato (per le recensioni vedi^10,11). Tuttavia, Rhod-2 ha un grosso svantaggio di perdite durante esperimenti a lungo termine; inoltre, è suddiviso tra mitocondri, altri organelli e il citosol, rendendo difficili le misurazioni assolute in diversi sottocompartimenti. Al contrario, utilizzando promotori specifici per tipo cellulare e sequenze di targeting del compartimento subcellulare, i GECI possono essere espressi in diversi tipi di cellule e compartimenti subcellulari per l’imaging Ca²⁺ specifico per cellula e compartimento in vitro o in vivo. Gli indicatori GCaMP Ca²⁺ basati sull’intensità di fluorescenza a lunghezza d’onda singola sono recentemente emersi come principali GECI^{12,13,14,15,16.} In questo articolo, forniamo un protocollo per il targeting dei mitocondri e l’espressione specifica del tipo cellulare di GCaMP5G e GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) in astrociti e neuroni e l’imaging dell’assorbimento mitocondriale di Ca²⁺ in questi tipi di cellule. Utilizzando questo protocollo, l’espressione di GCaMP6G/6s nei singoli mitocondri può essere rivelata e l’assorbimento di Ca²⁺ in risoluzione mitocondriale singola può essere ottenuto in astrociti e neuroni in vitro e in vivo.

Protocol

Le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell’Università del Missouri-Columbia. 1. Costruzione di plasmidi a DNA NOTA: Per l’imaging in vitro e in vivo, vengono costruiti plasmidi di DNA che codificano GCaMP5G/6s con promotori astrociti e neuroni specifici e sequenze di targeting mitocondriale. Inserire matrice mitocondriale (MM)-targeting sequ…

Representative Results

Lo scopo di questo studio è stato quello di fornire una metodologia per l’immagine di segnali mitocondriali Ca2+ utilizzando GECI in astrociti e neuroni in vitro e in vivo. I risultati dell’imaging mitocondriale Ca2+ sia in vitro che in vivo sono presentati qui. Segnalazione mitocondriale invitro Ca2+ in astrociti e neuroni in colturaL’assorbi…

Discussion

In questo articolo, forniamo un metodo e un protocollo per l’imaging dei segnali mitocondriali Ca²⁺ in astrociti e neuroni. Abbiamo implementato strategie di targeting dei mitocondri e specifiche per tipo cellulare per esprimere GECI GCaMP5G/6s. Per indirizzare GCaMP5G / 6 nei mitocondri, abbiamo incluso una sequenza di targeting dei mitocondri nei plasmidi. Per esprimere GCaMP5G/6s in astrociti e neuroni in vivo,abbiamo inserito un promotore astrocitario specifico gfaABC1D e un promotore neurone-spec…

Materials

Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Cyanoacrylate glue	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesive
Dissecting stereomicroscope	Nikon	SMZ 2B	Surgery
Dumont forceps with fine tip	Fine Science Tools	11255-20	for removal of dura
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick	Fisher Scientific	12-542A	for cranial window cover
High speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	with bone polishing drill bit
Injection syringe	Hamilton	2.5 ml	for viral injection
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg body weight
Low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9793	reducing movement artifacts
Metal frame	Custom-made	see Fig 1	for brain attachment to microscope stage
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	UMP3	Injection speed controller
Mouse stereotaxic device	Stoelting	51725	for holding mice
Perfusion chamber	Warner Instruments	64-0284
Persfusion system	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Self-regulating heating pad	Fine Science Tools	21061	to prevent hypothermia of mice
Sulforhodamine 101	Invitrogen	S-359	red fluorescent dye to label astrocytes
Surgical scissors, 12 cm	Fine Science Tools	14002-12	for dissection
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	for clearing of material
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg body weight