הדמיה מיטוכונדריאלית Ca2 + ספיגה אסטרוציטים ונוירונים באמצעות אינדיקטורים Ca2+ מקודדים גנטית (GECIs)

Summary

פרוקטוקול זה נועד לספק שיטה במבחנה ובהדמיה של ויוו מיטוכונדריאלי Ca²⁺ באסטרוציטים ונוירונים.

Abstract

Mitochondrial Ca²⁺ ממלא תפקיד קריטי בשליטה על אגירה ציטסולית Ca²⁺ , חילוף חומרים של אנרגיה, טרנסדוקציה של אותות הסלולר. עומס יתר של Ca² + מיטוכונדריאלי תורם למצבים פתולוגיים שונים, כולל ניוון עצבי ומוות תאים אפופטוטיים במחלות נוירולוגיות. כאן אנו מציגים סוג תא ספציפי ומיטוכונדריה מיקוד גישה מולקולרית עבור הדמיה מיטוכונדריאלית Ca^{2 +} אסטרוציטים נוירונים במבחנה ו in vivo. בנינו פלסמידים DNA קידוד מיטוכונדריה מיקוד גנטית מקודדים גנטית Ca^{2 +} אינדיקטורים (GECIs) GCaMP5G או GCaMP6s (GCaMP5G/6s) עם אסטרוציטים- נוירון ספציפיים ליזמים gfaABC1D ו- CaMKII ורצף מיקוד mitochondria (mito-). עבור הדמיה מיטוכונדריאלית במבחנה Ca²⁺ , הפלסמידים הועברו לאסטרוציטים ונוירונים מתורבתים כדי לבטא GCaMP5G/6s. עבור הדמיה מיטוכונדריאלית Ca²⁺ ב- vivo, וקטורים ויראליים הקשורים לאדנו (AAVs) הוכנו והוזרקו למוחות העכבר כדי לבטא GCaMP5G/6s במיטוכונדריה באסטרוציטים ונוירונים. הגישה שלנו מספקת אמצעי שימושי כדי לדמיין דינמיקה מיטוכונדריאלית Ca²⁺ אסטרוציטים נוירונים כדי ללמוד את הקשר בין איתות ציטוטוסולי ומיטוכונדריאלי Ca^{2 +} , כמו גם אינטראקציות אסטרוציטים-נוירונים.

Introduction

המיטוכונדריה הם אברונים תת-תאיים דינמיים ונחשבים למוקדי הכוח של התא לייצור אנרגיה. מצד שני, המיטוכונדריה יכולה לקחת את Ca²⁺ למטריקס בתגובה מקומי או ציטוסולי Ca^{2 +} עולה. ספיגת ספיגת Ca²⁺ מיטוכונדריאלית משפיעה על תפקוד מיטוכונדריאלי, כולל תהליכים מטבוליים כגון תגובות במחזור חומצה טריקרבוקסילית (TCA) וזרחן חמצוני, ומסדירה Ca^{2 +}חלבונים רגישים בתנאים פיזיולוגיים^1,2,3,4. מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} עומס יתר הוא גם דטרמיננטה למוות תאים, כולל נמק ואפופטוזיס בהפרעות מוחיות שונות^5,6,7. זה גורם לפתיחה של נקבוביות מעבר חדורות מיטוכונדריאליות (mPTPs) ושחרור של קופקטור caspase, אשר ליזום מוות תא אפופטוטי. לכן, חשוב ללמוד דינמיקה מיטוכונדריאלית Ca²⁺ וטיפול בתאים חיים כדי להבין טוב יותר את הפיזיולוגיה והפתולוגיה התאית.

המיטוכונדריה שומרת על מטריצה Ca²⁺ הומאוסטזיס באמצעות איזון בין ספיגת Ca²⁺ לשפכים. ספיגת קיקיון מיטוכונדריאלי Ca²⁺ מיושר בעיקר על ידי uniporters מיטוכונדריאלי^{2 +} (MCUs), בעוד Ca^{2 +} שפכים מיטוכונדריאליים הוא בתיווך Na⁺-Ca^{2 +}– Li⁺ מחליפים (NCLXs) ואת H⁺/ Ca^{2 +} מחליפים (mHCXs)⁸. האיזון יכול להיות מוטרד באמצעות גירוי של קולטנים מצמידים חלבון G (GPCRs)⁹. מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} הומאוסטזיס מושפע גם על ידי אגירה מיטוכונדריאלית על ידי היווצרות של xCa^{מסיס 2 +}-xPO₄x-xOH מתחמים⁸.

שינויים תאיים ומיטוכונדריאליים בריכוז Ca²⁺ ([Ca²⁺]) ניתן להעריך על ידי אינדיקטורים פלורסנט או זוהר Ca²⁺ . Ca²⁺ איגוד אינדיקטורים גורם לשינויים ספקטרליים, המאפשר הקלטה של תאים חינם [Ca²⁺] בזמן אמת בתאים חיים. שני סוגים של בדיקות זמינים כעת לניטור שינויים Ca²⁺ בתאים: אינדיקטורים כימיים אורגניים ומחווני Ca²⁺ מקודדים גנטית (GECIs). בדרך כלל, גרסאות שונות עם זיקות שונות של Ca²⁺ (בהתבסס על K_d),תכונות ספקטרליות (עירור ואורכי גל פליטה), טווחים דינמיים ורגישויות זמינים לשאלות הביולוגיות הנחקרות. למרות אינדיקטורים אורגניים סינתטיים רבים Ca^{2 +} שימשו עבור הדמיה ציטוטוסולי Ca^{2 +} , רק כמה ניתן לטעון באופן סלקטיבי במטריצה המיטוכונדריאלית עבור הדמיה מיטוכונדריאלית Ca^{2 +} , עם רוד-2 להיות הנפוץ ביותר (עבור ביקורות לראות^10,11). עם זאת, לרוד-2 יש חיסרון גדול של דליפה במהלך ניסויים ארוכים; בנוסף, הוא מחולק בין המיטוכונדריה, אברונים אחרים ואת cytosol, מה שהופך מדידות מוחלטות subcompartments שונים קשה. לעומת זאת, באמצעות מקדמים ספציפיים מסוג תא ורצפי פילוח תאים תת-תאיים, GECIs יכולים לבוא לידי ביטוי בסוגי תאים ותאים תת-תאיים שונים להדמיית Ca²⁺ ספציפי לתאים ולאדר במבחנה או ב- vivo. מדדי GCaMP Ca²⁺ מבוססי עוצמת פלואורסצנטיות באורך גל אחד התגלו לאחרונה כמדדי GECIs גדולים^{12,13,14,15,16}. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול עבור מיטוכונדריה-פילוח וביטוי ספציפי סוג התא של GCaMP5G ו- GCaMP6s (GCaMP5G/6s) אסטרוציטים נוירונים, הדמיה ספיגת Ca²⁺ מיטוכונדריאלי בסוגי תאים אלה. באמצעות פרוטוקול זה, הביטוי של GCaMP6G/6s במיטוכונדריה בודדת ניתן לגלות, ו ספיגת Ca^{2 +} ברזולוציה מיטוכונדריאלית אחת ניתן להשיג אסטרוציטים נוירונים במבחנה ו in vivo.

Protocol

נהלים הנוגעים לבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) באוניברסיטת מיזורי-קולומביה. 1. בניית פלסמידים DNA הערה: עבור דימות במבחנה ובהדמיית ויוו, נבנים פלסמידים DNA המקודדים GCaMP5G/6s עם מקדמים ספציפיים לאסטרוציטים ונוי?…

Representative Results

מטרת מחקר זה הייתה לספק מתודולוגיה לדמות אותות מיטוכונדריאליים Ca2 + באמצעות GECIs באסטרוציטים ונוירונים במבחנה וב- in vivo. תוצאות של הדמיה במבחנה ו in vivo mitochondrial Ca2+ מוצגים כאן. אין ויטרו מיטוכונדריאלי Ca2+ א…

Discussion

במאמר זה, אנו מספקים שיטה ופרוטוקול להדמיה של אותות מיטוכונדריאליים Ca²⁺ באסטרוציטים ונוירונים. יישמנו אסטרטגיות מיטוכונדריה-פילוח וסוג תאים כדי לבטא GECI GCaMP5G/6s. כדי למקד GCaMP5G/6s במיטוכונדריה, כללנו רצף מיטוכונדריה מיקוד ב plasmids. כדי לבטא GCaMP5G/6s אסטרוציטים נוירונים ב vivo, הכנסנו מקדם ס…

Materials

Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Cyanoacrylate glue	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesive
Dissecting stereomicroscope	Nikon	SMZ 2B	Surgery
Dumont forceps with fine tip	Fine Science Tools	11255-20	for removal of dura
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick	Fisher Scientific	12-542A	for cranial window cover
High speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	with bone polishing drill bit
Injection syringe	Hamilton	2.5 ml	for viral injection
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg body weight
Low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9793	reducing movement artifacts
Metal frame	Custom-made	see Fig 1	for brain attachment to microscope stage
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	UMP3	Injection speed controller
Mouse stereotaxic device	Stoelting	51725	for holding mice
Perfusion chamber	Warner Instruments	64-0284
Persfusion system	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Self-regulating heating pad	Fine Science Tools	21061	to prevent hypothermia of mice
Sulforhodamine 101	Invitrogen	S-359	red fluorescent dye to label astrocytes
Surgical scissors, 12 cm	Fine Science Tools	14002-12	for dissection
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	for clearing of material
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg body weight