遺伝子組み換えCa2+ 指標(GEC)を用いたアストロサイトとニューロンのイメージングミトコンドリアCa2+ 取り込み
Summary
このプロクトーコルは、アストロサイトおよびニューロン におけるインビトロ および インビボ ミトコンドリアCa2+ イメージングの方法を提供することを目的としています。
Abstract
ミトコンドリアCa2+は、細胞質Ca2+緩衝、エネルギー代謝、細胞シグナル伝達を制御する上で重要な役割を果たしています。ミトコンドリアCa2+の過負荷は、神経変性および神経疾患におけるアポトーシス細胞死を含む様々な病理学的状態に寄与する。ここでは、インビトロおよびインビボのアストロサイトおよびニューロンにおけるミトコンドリアCa2+イメージングに対する細胞型特異的およびミトコンドリア標的分子アプローチを提示する。ミトコンドリア標的化遺伝子組み換えCa2+指標(GECIs)GCaMP5GまたはGCaMP6s(GCaMP5G/6s)をコードするDNAプラスミドをアストロサイトおよびニューロン特異的プロモーターgfaABC1DおよびCaMKIIおよびミトコンドリアターゲティング配列(ミトコンドリア標的配列)で構築した。インビトロミトコンドリアCa2+イメージングでは、PMIDを培養したアストロサイトおよびニューロンにトランスフェクトしてGCaMP5G/6sを発現させた。インビボミトコンドリアCa2+イメージングでは、アデノ関連ウイルスベクター(AAV)を調製し、マウス脳に注入し、アストロサイトおよびニューロンのミトコンドリアでGCaMP5G/6sを発現させた。我々のアプローチは、細胞質とミトコンドリアCa2+シグナル伝達の関係を研究するために、アストロサイトとニューロンにおけるミトコンドリアCa2+ダイナミクスを画像化する有用な手段を提供する。
Introduction
ミトコンドリアは、細胞内の動的な小器官であり、エネルギー生産のための細胞大国と考えられています。一方、ミトコンドリアは、局所的または細胞質Ca2+上昇に応答して、母体にCa2+を取ることができます。ミトコンドリアCa2+取り込みは、三カルボン酸(TCA)サイクルおよび酸化リン酸化における反応などの代謝過程を含むミトコンドリア機能に影響を及ぼし、生理学的条件下でCa2+感受性タンパク質を調節する1、2、3、4。ミトコンドリアCa2+過負荷はまた、細胞死の決定要因であり、様々な脳障害における壊死およびアポトーシスを含む5、6、7。これは、ミトコンドリア透過性遷移細孔(mpPPs)の開口部とアポトーシス細胞死を開始するカスパーゼ補因子の放出を引き起こす。したがって、細胞生理学と病理をよりよく理解するために、生きている細胞におけるミトコンドリアCa2+のダイナミクスと取り扱いを研究することが重要です。
ミトコンドリアは、Ca2+取り込みと流出のバランスをとってマトリックスCa2+ホメオスタシスを維持します。ミトコンドリアCa2+取り込みは主にミトコンドリアCa2+ユニポーター(MCUs)によって媒介され、ミトコンドリアCa2+流出はNa+-Ca2+-Li+交換器(NCLX)とH+/Ca2+交換器(mHCXs)8によって媒介される。バランスは、Gタンパク質共役受容体(GPDR)9の刺激を通じて摂動することができる。ミトコンドリアCa2+ホメオスタシスも、不溶性xCa 2+-xPO4 x-xOH複合体8の形成によるミトコンドリア緩衝の影響を受ける。
細胞内およびミトコンドリア濃度の変化([Ca2+])は、蛍光または発光Ca2+指標によって評価することができる。標識へのCa2+結合はスペクトル修飾を引き起こし、生細胞でのリアルタイムでの自由な細胞[Ca2+]の記録を可能にする。現在、細胞内のCa2+の変化を監視するために、有機化学指標と遺伝的にコード化されたCa2+指標(GECI)の2種類のプローブが利用可能です。一般的に、異なるCa2+親和性(Kdに基づく)、スペクトル特性(励起および発光波長)、動的範囲、および感度が調査中の生物学的問題に対して利用可能である異なる変異体が利用可能である。多くの合成有機Ca2+指標が細胞質Ca2+イメージングに使用されていますが、ミトコンドリアCa2+イメージング用のミトコンドリアマトリックスに選択的にロードできるのはごくわずかですが、Rhod-2が最も広く使用されています(レビューでは10,11を参照)。しかし、Rhod-2 は、長い時間経過実験の間に漏れの大きな欠点があります。さらに、ミトコンドリア、他のオルガネラ、サイトゾルの間で分割され、異なるサブコンパートメントでの絶対測定が困難になります。対照的に、細胞型プロモーターおよび細胞内区画ターゲティング配列を用いることによって、GECIは、インビトロまたはインビボで細胞およびコンパートメント特異的なCa2+イメージング用の異なる細胞タイプおよび細胞下コンパートメントで発現することができる。単一波長蛍光強度ベースのGCaMP Ca2+指標は、最近、主要なGEIS12、13、14、15、16として登場しました。本稿では、アストロサイトおよびニューロンにおけるGCaMP5GおよびGCaMP6s(GCaMP5G/6s)のミトコンドリア標的化および細胞型特異的発現のプロトコルと、これらの細胞タイプにおけるミトコンドリアCa2+の取り込みについて説明する。このプロトコルを用いて、個々のミトコンドリアにおけるGCaMP6G/6sの発現が明らかにでき、そして単一ミトコンドリア分解能におけるCa2+取り込みは、インビトロおよびインビボのアストロサイトおよびニューロンにおいて達成することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、アストロサイトやニューロンにおけるミトコンドリアCa2+信号をイメージングする方法とプロトコルを提供します。GECI GCaMP5G/6sを表現するために、ミトコンドリアターゲティングおよび細胞型特異的戦略を実施しました。ミトコンドリアでGCaMP5G/6sを標的にするために、プラスミドにミトコンドリアターゲティング配列を含む。生体内のアストロサイトおよびニューロ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所神経障害・脳卒中研究所(NINDS)がR01NS069726とR01NS094539をSDに付与することによって支援されました。私たちは、オーディオ録音のためにエリカDeMersに感謝します。
Materials
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
References
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