Summary
Bu protokol, 5'-splice bölgesi mutasyonlarının birleştirme üzerindeki etkisini izlemek için bir minigene muhabiri testini açıklar ve mutasyona bağlı birleştirme inhibisyonunun kurtarılması için bastırıcı U1 snRNA geliştirir. Muhabir ve bastırıcı U1 snRNA yapıları HeLa hücrelerinde ifade edilir ve birleştirme astar uzantısı veya RT-PCR ile analiz edilir.
Abstract
Gen ekspresyonu sırasında, mRNA öncesi birleştirmenin hayati adımı, olgun mRNA'nın sitoplazmik ihracatından önce eksonları birleştirmek ve intronları çıkarmak için spliceosomal komplekslerin doğru tanınmasını ve spliceosomal komplekslerin verimli bir şekilde birleştirilmesini içerir. Birleştirme verimliliği, splice bölgelerinde mutasyonların varlığı, trans-etkili birleştirme faktörlerinin etkisi veya terapötiklerin aktivitesi ile değiştirilebilir. Burada, herhangi bir eksonun birleştirme verimliliğini izlemek için uygulanabilecek hücresel bir test protokolünü açıklıyoruz. Tahlil, memeli hücrelerinde geçici transfeksiyon ile ifade edilebilen uyarlanabilir bir plazmid kodlu 3-exon/2-intron minigene reporter kullanır. Transfeksiyon sonrası, toplam hücresel RNA izole edilir ve muhabir mRNA'daki ekson birleştirmenin verimliliği primer uzatma veya yarı nicel ters transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile belirlenir. 5′ splice-site mutasyonları ile ilişkili hastalığın etkisinin muhabirde tanıtılarak nasıl belirlenebileceğini anlatıyoruz; ve bu mutasyonların bastırılmasının U1 küçük nükleer RNA (snRNA) yapısı ile birlikte transfeksiyon ile nasıl sağlanabileceği, mRNA öncesi bölgelerdeki exon-intron kavşaklarında 5′-splice bölgeleri ile temel alan 5′ bölgesinde telafi edici mutasyonlar taşıyan yapı. Böylece, muhabir mutant 5′ splice-sites tanıma geliştirmek için terapötik U1 parçacıklarının tasarımı için kullanılabilir. Artırıcı veya susturucu dizilerini birleştirme gibi CIS etkili düzenleyici sitelerin muhabire eklenmesi, U1 snRNP'nin belirli bir alternatif birleştirme faktörünün aracılık ettiği düzenlemedeki rolünü incelemek için de kullanılabilir. Son olarak, hücreleri ifade eden muhabir, potansiyel terapötiklerin konsitutive pre-mRNA birleştirme veya mutant taşıyan eksonlar üzerindeki etkisini belirlemek için küçük moleküllerle inkübe edilebilir 5′ splice siteleri. Genel olarak, muhabir tahlilleri, temel birleştirme mekanizmalarını ve birleştirme ile ilişkili hastalıkları incelemek için çeşitli koşullarda birleştirme verimliliğini izlemek için uygulanabilir.
Introduction
Pre-mRNA birleştirme, kodlamayan intronları kaldıran ve olgun mRNA oluşturmak için kodlama eksonlarını hassas bir şekilde lige eden önemli bir işlem adımıdır. Ekson-intron kavşaklarında konsensüs dizilerinin tanınması, 5′-splice bölgesi ve 3′-splice bölgesi olarak adlandırılır, birleştirme makinelerinin bileşenleri tarafından birleştirme işlemini başlatır. U1 küçük nükleer ribonükleoprotein (snRNP), U1 snRNA'nın mRNA1 öncesi ile baz eşleşmesi ile 5′-splice bölgesini tanır. 5′-splice bölge dizilerini değiştiren genetik kalıtsal mutasyonlar birçok hastalıkla ilişkilidir2,3. U1 snRNA'nın mutant 5′-splice siteleri ile temellenme kaybının, etkilenen transkriptin çevirisini tehlikeye atabilecek sapkın birleştirmeye neden olduğu öngörülebilir. Birleştirme kusurlarını düzeltmek için potansiyel bir terapötik yaklaşım, 5′-splice bölgesi ile temel alan 5′-bölgesinde telafi edici nükleotid değişiklikleri taşıyan modifiye U1 snRNA tarafından mutasyonların bastırılmasını içerir. Ekson spesifik U1 snRNA'ları olarak da adlandırılan bu tür modifiye U1 snRNA'larının, ekstifleme kusurlarının tersine çevrilmesinde etkili olduğu ve kurtarılan mRNA4,5,6,7,8'den protein ekspresyonunda artışa neden olduğu bulunmuştur.
Burada, U1 snRNP tamamlama testini, 5′-ss mutasyonunun bir ekzonun bir eklenmesi üzerindeki etkisinin değerlendirilmesine izin veren ve ayrıca akson dahil etmenin kurtarılmasını sağlamak için değiştirilmiş U1 snRNA'larının geliştirilmesi için de kullanılabilen muhabir tabanlı bir hücresel birleştirme tahlili olarak tanımlıyoruz. Ayrıca, bir aradaki muhabir transkriptlerinin primer uzantısı ve RT-PCR ile izlenmesi ve değiştirilmiş U1 snRNA'ların primer uzantısı ve RT-qPCR ile ifadesinin belirlenmesi için protokoller sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reaktifler ve tamponlar
NOT: Vakum filtreleri kullanılarak yapılan tüm sterilizasyonlar biyogüvenlik kabininde 0,2 μm polietrülfon (PES) membran ile yapılmalıdır.
- 1,0 L deiyonize suya 1,0 mL dietilpirokarbonat (DEPC) ekleyerek RNase içermeyen su hazırlayın, oda sıcaklığında (RT) en az 1 saat karıştırın, iki kez otoklavlayın ve kullanmadan önce RT'ye soğutun.
- Bir paket DMEM tozu (13,4 g), 3,7 g sodyum bikarbonat, 100 mL fetal sığır serumu (FBS), penisilin ve streptomisin ile ~800 mL steril deionize suyu karıştırarak Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortasını (DMEM) hazırlayın. DMEM'de penisilin ve streptomisinin son konsantrasyonu sırasıyla 50 U/mL ve 50 μg/mL olmalıdır. pH'ı 7,4'e ayarlayın ve ardından steril deiyonize su ile hacmi 1,0 L'ye ayarlayın. Filtrasyon ile sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
- 25,6 g disodium hidrojen heptahydrat (Na2HPO4· ekleyerek 10x fosfat tamponlu salin (10x PBS) hazırlayın 7H2O), 2 g potasyum dihidrojen fosfat (KH2PO4), 2 g potasyum klorür (KCl) ve 80 g sodyum klorür (NaCl) ila 800 mL deiyonize su. Çözün ve hacmi 1,0 L'ye kadar yapın.
- 186,1 g Na2•EDTA•2H2O'yu ~800 mL deiyonize suya eriterek 0,5 M etilen diamin tetra-asetik asit (EDTA) hazırlayın. pH'ı 8.0'a ayarlayın ve ardından steril deiyonize su ile hacmi 1.0 L'ye ayarlayın. Filtrasyon ile sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
- 100 mL 10x tripsin (%2,5), 2 mL 0,5 M EDTA karıştırarak 1x tripsin-EDTA çözeltisi hazırlayın ve 1,0 L'ye kadar 1x PBS ekleyin. 1-2 hafta boyunca 4 °C'de saklayın veya uzun süreli kullanım için -20 °C'de dondurun.
- 14,4 mL formamid ve 0,6 mL 0,5 M EDTA'yı 15 mL'lik son hacim için karıştırarak 2x formamid DNA/RNA yükleme boyası hazırlayın. Bromofenol mavisi ve ksilen siyanol tozunu% 0.02'lik son konsantrasyona ekleyin ve 4 ° C'de saklayın.
NOT: Formamid toksik ve aşındırıcıdır. Ek güvenlik önerileri için malzeme güvenliği veri sayfalarını okuyun. - 54,0 g tris tabanı, 27,5 g borik asit ve 20 mL 0,5 M EDTA'yı ~800 mL deiyonize suya karıştırarak 5x Tris/Borat/EDTA (5x TBE) tampon hazırlayın. Deiyonize su ile hacmi 1,0 L'ye kadar çözmek ve yapmak için karıştırın.
- 200 mL 5x TBE, 250 mL%40 19:1 bis/akrilamid ve 450,5 g üre karıştırarak üre-poliakrilamid jel elektroforez (üre-PAGE) çözeltisi hazırlayın. Daha sonra 1,0 L'ye kadar deiyonize su ekleyin, malzemeler tamamen çözünene kadar karıştırın, sonra filtrasyonla sterilize edin ve 4 °C'de bir kehribar cam şişede saklayın.
NOT: Bis/akrilamid toksiktir. Ek güvenlik prosedürleri için malzeme güvenliği veri sayfalarını okuyun. - 10 mL deiyonize suda 1 g APS eriterek % 10 amonyum persülfat (APS) hazırlayın ve 4 °C'de depolayın.
2. HeLa hücrelerinin muhabir ve U1 snRNA plazmidleri ile birlikte aktarılması
NOT: Hela hücrelerinin transfeksiyonu steril koşullarda biyolojik bir güvenlik kabininde yapılmalıdır. Tüm malzemelerin dış yüzeyi biyolojik güvenlik kabinine sokulmadan önce% 70 etanol ile püskürtülmelidir.
- Hücrelerin yaklaşık% 80-90 birleştiği her 2-3 günde bir geçerek 37 °C'lik bir inkübatörde Hela hücrelerini% 5 CO2 ile koruyun.
- HeLa hücrelerini geçirmek için, harcanan ortamı aspire edin ve daha sonra 3 dakika boyunca 37 °C'de 1 mM EDTA içeren% 0.25 tripsin 3 mL ile hücreleri kuluçkaya yatırın.
- Kuluçkadan sonra, 7 mL taze DMEM ekleyin. Hücre süspansiyonu 10 mL'lik bir tüpe aktarın, 5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj.
- Hücre peletini 10 mL taze DMEM'de yeniden biriktirin ve ardından hücreleri% 20 izdihamda yeni bir doku kültürü çanakları üzerine plakalayın.
- Geçici transeksiyonlar için, Hela hücrelerini temiz bir hemositometre kaydırağı ile sayın ve 2,5 x 105 hücre /mL yoğunluğa sahip bir süspansiyon hazırlayın.
- 12 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 2,5 x 105 hücre/mL Hela hücre süspansiyonunun 1,0 mL'lik tohumu ve 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yaslanın.
- Ertesi gün, harcanan ortamı epire edin ve serum ile 0,8 mL taze DMEM ekleyin.
- Yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne 0,2 μg Dup51 veya Dup51p muhabir plazmidi, 1,8 μg pcDNA, pNS6U1 veya pNS6U1-5a plazmid ve 100 μL transfeksiyon ortamı ekleyerek Çözüm I'i hazırlayın.
- Numune başına 100 μL transfeksiyon ortamı ve 4,0 μL transfeksiyon reaktifi ekleyerek tüm numunelerin transfeksiyon için Çözüm II'nin ana karışımını hazırlayın.
- Çözelti I içeren her mikrosantrifüj tüpüne 100 μL Çözelti II ekleyerek transfeksiyon karışımını hazırlayın.
- Transfection 15 s için karıştırılır, rt'de 10 s için 3.000 x g'da bir masa üstü mikrosantrifüjde santrifüj ve ardından RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- 200 μL'lik transfeksiyon karışımının tamamını 12 kuyulu HeLa hücre plakasının bir kuyusuna ekleyerek kuyu başına 1,0 mL'lik son bir hacim elde edin ve plakayı 48 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Kuluçkadan sonra, ticari olarak mevcut guanidin tiyosiyanat ve fenol çözeltisi ile transfected HeLa hücrelerinden RNA çıkarın.
NOT: Bu reaktif fenol içerir ve bu adım bir duman davlumbazında yapılmalıdır. Çıkarılan RNA'nın yeniden sulanması için DEPC arıtılmış su kullanılması önerilir.- Harcanan ortamı epire edin ve her kuyuya 500 μL reaktif ekleyin. RT'de 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
- Yukarı ve aşağı pipetleme ile homojenize edin. Ardından çözeltiyi yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- 15 sn için 100 μL kloroform ve girdap ekleyin.
- RT'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj.
- RNA içeren 200 μL'lik üst sulu katmanı yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Her RNA örneğine 2 μg glikojen ve 200 μL izopropanol ekleyin. Tüpleri ters çevirerek karıştırın.
- RNA çökeltisini 4 °C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleme ile toplayın.
- RNA peletini bozmadan üstnatant çıkarın ve atın.
- Peletin% 70 etanol 1.0 mL ekleyerek, tüpleri ters çevirerek ve Adım 2.13.7'de açıklandığı gibi santrifüjleyerek iki kez yıkayın.
- Hava peleti RT'de ~10-20 dakika kurutun ve RNA'yı 10-20 μL RNase içermeyen suda yeniden boşaltın.
- Desjardins ve Conklin9 tarafından tanımlandığı gibi absorbansı 260 nm'de ölçerek RNA konsantrasyonu belirleyin.
- Astar uzatmaya devam edin veya RNA örneklerini -20 °C'de saklayın. İzole RNA 6-12 ay boyunca -20 °C'de saklanabilir.
3. Oligonükleotidlerin 32P etiketlemesi
NOT: 32P-ATP ve 32P etiketli oligonükleotidlerin kullanımını içeren adımlar, yetkili kurumsal kuruluşlardan onay alan eğitimli bireyler tarafından akrilik bir kalkanın arkasında gerçekleştirilmelidir. Aşağıda açıklanan protokol oligonükleotidlerin, Dup3r ve U17-26-R'nin etiketlenebilmesi için ve üre-PAGE için işaretleyiciler için kullanılabilir. Oligonükleotidlerin ve boyut dışlama boncuklarının yeniden sulanması için DEPC arıtmalı su kullanılması önerilir.
- Tablo 1'de açıklandığı gibi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne oligonükleotid, T4 polinükleotid kinaz (T4 PNK), T4 PNK tamponu ve 32P-ATP ekleyin. Karışıma son olarak 32P-ATP ekleyin; Bu çok önemli.
NOT: Radyoaktif çözümlerin eklenmesi için filtre ipuçlarının kullanılması önerilir. - 37 °C'de bir su banyosunda 30 dakika kuluçkaya yatır.
- Etiketleme reaksiyonları inkübasyon yaparken, ~10 s için hafifçe girdaplanarak kesilen 25 kDa moleküler ağırlıkla boyut dışlama boncuklarını yeniden depolayın.
NOT: Boyut hariç tutma boncukları üreticinin talimatlarına göre hazırlanmalı ve 4 °C'de% 25 etanolde% 50 süspansiyon olarak saklanmalıdır. - Yeniden sulanan boncukların 600 μL'lik kısmını 1,5 mL toplama tüpüne yerleştirilmiş tek kullanımlık bir mini sütuna aktararak ve boncuk stoğunu 4 °C'ye döndürerek sütunları hazırlayın.
- RT'de 1 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüj ve akışı atın.
- Sütuna 300 μL RNase içermeyen su ekleyerek boncukları yıkayın.
- 3.5. adımları yineleyin. ve 3.6. ve mini sütunu yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın.
- Kinaz reaksiyon karışımını, rt'de 1 dakika boyunca 5000 x g'da boyut dışlama boncuk sütununa ve santrifüje ekleyin.
- 32P etiketli oligonükleotide sahip akışı toplayın ve kaydedin ve tüm uçları ve tüpleri akrilik bir atık kutusuna atın.
- 32P etiketli oligonükleotid'i 2,5 μM'lik son konsantrasyona seyreltmek için 20 μL RNase içermeyen su ekleyin.
NOT: Etiketli işaretleyicileri üre-PAGE jellerine yükleme için gerektiği şekilde seyreltin. - Etiketli oligonükleotid'i -20 °C'de akrilik bir mikrotüp kutusunda saklayın veya astar uzatma analizine devam edin.
4. Ekli muhabir transkriptlerinin primer uzantıya göre analizi
NOT: Kullanmadan önce yüzeylerin ve ekipmanların RNase inaktive reaktifi ile temizlenmesi önerilir.
- Hela hücrelerinden çıkarılan 2,0 μg RNA'yı ayrı 200 μL mikrosantrifüj tüplerine ekleyin ve hacmi 6,55 μL'ye çıkarmak için RNase içermeyen su ekleyin.
- Tablo 2'de gösterildiği gibi seyreltilmiş 32P-Dup3r ve dNTP'lerle Master Mix I hazırlayın ve RNA örnekleri içeren her PCR tüpüne karışımın 0,9 μL'sini ekleyin.
- Tüpleri kuluçkaya yatırın, önce 65 °C'de 5 dakika, sonra 1 dakika buzda.
- Tablo 2'de gösterildiği gibi 5x First Strand Buffer, dithiothreitol (DTT), RNase inhibitörü ve ters transkriptaz ile Master Mix II hazırlayın.
- RNA ve Master Mix 1 içeren her tüpe 2,55 μL karışım ekleyin; reaksiyonun toplam hacmi 10 μL olmalıdır.
- Tüpleri kuru bir banyoya veya termal bir çevrime aktarın ve kuluçkaya yatırın, önce 60 dakika 50 °C'de ve sonra 15 dakika boyunca 70 °C'de.
- İnkübasyondan sonra, her numuneye 10 μL 2x formamid RNA yükleme boyası ekleyin ve -20 °C'de bir akrilik kutuda saklayın veya 14 cm uzunluğunda bir jel kullanarak parçaların üre-PAGE ile ayrılmasına ve 8.
- Bir görüntü analiz yazılımı ile jel görüntünün densitometrik taramasını gerçekleştirin ve aşağıda gösterildiği gibi exon 2 ekleme yüzdesini hesaplamak için dahil edilen ve atlanan ürünlerin bant yoğunluklarını kullanın.
5. Birleşmiş muhabir transkriptlerinin floresan RT-PCR ile analizi
NOT: Aşağıda açıklanan RT-PCR analizi, cDNA sentezi için rastgele altıgenler ve ekli ürünlerin PCR amplifikasyonu için etiketsiz Dup8f ve Cy5 etiketli Dup3r oligonükleotidlerin bir kombinasyonunu kullanır.
- cDNA sentezi için, transfected Hela hücrelerinden çıkarılan 2,0 μg RNA'yı ayrı 200 μL mikrosantrifüj tüplerine ekleyin ve hacmi 11,0 μL'ye çıkarmak için RNase içermeyen su ekleyin.
- Tablo 3'te gösterildiği gibi rastgele altıgenler ve dNTP içeren Master Mix I'i hazırlayın ve her numuneye 2,0 μL karışım ekleyin. Kuluçkaya yaslanın, önce 65 °C'de 5 dakika sonra 1 dakika buzda.
- Tablo 3'te gösterildiği gibi First Strand Buffer, RNase inhibitörü, DTT ve ters transkriptaz içeren Master Mix II'yi hazırlayın ve RNA ve Master Mix I içeren her tüpe karışımın 7,0 μL'sini ekleyin.
- Tüpleri 10 dakika RT'de tutun ve ardından 60 dakika 50 °C'de ve 15 dakika boyunca 70 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Tamamlanan cDNA reaksiyonları -20 °C'de saklanabilir. - PCR için, her cDNA örneğinin 1,0 μL'lik (100 ng/μL) kısmını yeni PCR tüplerine aktarın.
- Tablo 4'te açıklandığı gibi Dup8f, Cy5-Dup3r, dNTP'ler, Taq tamponu, Taq polimeraz ve sudan oluşan bir ana karışım hazırlayın ve cDNA içeren her tüpe karışımın 11,5 μL'sini ekleyin.
- 3 dakika boyunca 94 °C'de ilk denatürasyon adımına sahip bir termal çevrimleyici kullanarak PCR gerçekleştirin; ardından 20 denatürasyon döngüsü (30 s için 94 °C), tavlama (30 s için 65 °C) ve uzatma (15 s için 72 °C) ve 5 dakika boyunca 72 °C'de sonlandırma adımı.
- Her tüpe 12,5 μL 2x formamid DNA yükleme boyası ekleyin ve 5 dakika boyunca 95 °C'de ısıtın.
- PCR reaksiyonlarını -20 °C'de saklayın veya Adım 8.1-8.4'te açıklandığı gibi üre-PAGE ile devam edin.
- Elektroforezden sonra, cam plakaları elektroforezi aparatından çıkarın ve jeli görselleştirmek için bir floresan görüntüleyici kullanarak tarayın.
- Jel görüntüsünün densitometrik taramasını gerçekleştirin ve Adım 4.8'de açıklandığı gibi ekson 2 ekleme yüzdesini hesaplamak için dahil edilenlerin ve atlanan ürünlerin bant yoğunluğunu kullanın.
6. Astar uzantısına göre varyant U1 snRNA ifadesinin analizi
- Hela hücrelerinden çıkarılan 2,0 μg RNA'yı ayrı 200 μL mikrosantrifüj tüplerine ekleyin ve hacmi 4,325 μL'ye çıkarmak için RNase içermeyen su ekleyin ve ardından Tablo 5'te gösterildiği gibi dATP ekleyin.
- Her tüpe 32P-U17-26-R oligonükleotid 10.000 CPM ekleyin.
NOT: 32P-U17-26-R 'lik 10.000 cpm/μL çözeltisi hazırlamak için (Adım 3'ten itibaren), etiketli oligonükleotid (1:20 seyreltme) seyreltin, bir scintillation sayacı kullanarak 1.0 μL'de cpm belirleyin, ve yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde 10.000 cpm / μL'lik bir çözelti hazırlamak için deiyonize su ile daha da seyreltin. - 65 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatır, sonra 1 dakika buzda.
- Tablo 5'te gösterildiği gibi 5x İlk Strand Buffer, RNase inhibitörü, DTT ve ters transkriptaz ile bir ana karışım hazırlayın ve her numuneye 1,8 μL karışım ekleyin.
- Kuluçkaya yaslanın, önce 10 dakika RT'de, sonra 10 dakika boyunca 42 °C'de.
- İnkübasyondan sonra, her numuneye 10 μL 2x formamid RNA yükleme boyası ekleyin ve -20 °C'de bir akrilik kutuda saklayın veya parçaların 38 cm uzunluğunda bir jel kullanarak üre-PAGE ile ayrılmasına devam edin (bkz. Adım 8).
7. RT-qPCR ile varyant U1 snRNA ifadesinin analizi
- Yukarıda Açıklandığı gibi hazırlanan cDNA stoğunu Adım 5.1 - 5.4'te 0.2 ng/μL konsantrasyonda seyreltin.
- Pipet 5.0 μL seyreltilmiş cDNA üç taraflı 96-well qPCR plakanın bireysel kuyularına. Şablonsuz denetim (NTC) için cDNA yerine deiyonize su ekleyin.
- U1 ve U2 snRNA'lar için ileri ve ters astarlardan ve Tablo 6'da gösterildiği gibi sudan oluşan iki ayrı astar karışımı hazırlayın.
NOT: U1 ve U2 snRNA'ya özgü astarlar için sıralar Tablo 7'de verilmiştir. - Numuneye ve NTC kuyularına U1 ve U2 snRNA astar karışımının 5,0 μL'lik kısmını ekleyin.
- Her kuyuya 10,0 μL gerçek zamanlı PCR karışımı ekleyin.
- Plakaları optik bir filmle kapatın, ardından kuyuların dibine tepkileri toplamak için RT'de 2 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin.
- QPCR'yi 10 dakika boyunca 95 °C'de ilk denatürasyon adımıyla gerçekleştirin, ardından hedef ampliconların eşik nicelik döngüsü (Cq) değerlerini toplarken denatürasyon (15 s için 95 °C) ve tavlama/uzatma (60 s için 62 °C) içeren 2 adımlı bir protokolün 40 döngüsü.
- U1 ve U2 snRNA reaksiyonları için ayrışma eğrisinde tek bir tepe haline gelen tek bir tepeyi kontrol larak qPCR reaksiyonunu tamamlar.
- Cq değerlerinden, U1 ve U2 snRNA'ları için delta Cq (ΔCq) değerini pcDNA denetimine kıyasla hesaplayın.
- Tüm örnekler için aşağıda gösterildiği gibi ΔΔCq değerini kullanarak U2 ile karşılaştırıldığında U1 varyantı SnRNA ifadesini U1'in göreli miktarı (RQ) olarak belirleyin.
8. Üre-PAGE jellerinin kurulumu ve çalıştırı
NOT: Cam plakaların montajı ve jel çalıştırma aparatı üreticinin talimatlarına göre yapılmalıdır. %10 üre-PAGE jelinin dökümü Summer ve ark.10 tarafından daha önce açıklanan bir protokole göre gerçekleştirilebilir. İşaretçilerin ve örneklerin hazırlanması ve jellerin çalıştırılması ve görselleştirilmesi ile ilgili adımlar aşağıda açıklanmıştır. İsteğe bağlı olarak, jelin cam plakalara yapışmasını önlemek için, iç yüzey yüzeye çözeltinin 1 mL'si eklenerek ve doku ile tüm yüzeye eşit olarak yayılarak silikon çözelti ile kaplanabilir. Kuruduktan sonra, plakalar deiyonize su ile yıkanmalı ve tekrar kurutulmalıdır.
DİkKAT: Eczacılık dışı akrilamid nörotoksiktir ve malzeme güvenliği veri sayfasında önerilen korumalarla ele alınmalıdır.
- Astar uzatma numunelerini ve işaretleyicilerini 95 °C'de 5 dakika ısıtıp ardından RT'de 5 sn için 3.000 x g'da bir masa üstü mikrosantrifüjde santrifüjle hazırlayarak hazırlayın.
- İşaretleyicileri ve numuneleri yüklemeden önce, yerleşik üreyi çıkarmak için kuyuları 1x TBE tamponu ile boşaltın.
- 10 μL / numune / kuyu yükleyin ve jeli 300-500V'da 2-3 saat boyunca veya ksilen siyanol dibe ulaşana kadar çalıştırın.
NOT: 32P etiketli işaretleyicinin yaklaşık 1.000 cpm'si yüklenebilir. - Elektroforezden sonra cam plakaları elektroforezi aparatından çıkarın.
- İki plakayı dikkatlice ayırın, böylece jel her iki cam yüzeye de düz bir şekilde uzanır ve jeli bir filtre kağıdına aktarın ve plastik sargı ile örtün.
- Jel kurutma makinesi kullanarak jeli filtre kağıdında 80 °C'de 30 dakika vakumla kurutun.
- Kurutulmuş jeli fosfor görüntüleme kasetine yerleştirin ve gece boyunca RT'de tutun.
NOT: Fosfor ekranı kullanılmadan önce bir ışık kutusu kullanılarak silinmelidir. - Jel görüntüsünü görselleştirmek için ekranı çıkarın ve fosfor görüntüleyiçi kullanarak tarayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Üç ekson-iki intron minigene olan birleştirme muhabiri Dup51, insan β-globin geninden türetilmiştir ve daha önce tanımlanmıştır (Şekil 1A)11,12 . Protocadherin 15 (PCDH15) geni13'ün ekson 3'lüğünde meydana gelen Usher sendromu ilişkili 5'-splice bölgesi mutasyonlarını tanıtarak dup51p adlı bir mutant muhabir oluşturduk. Ekson 2-intron 2 kavşağında 5'-splice site dizisi CAG/GUUGGUAUC'tan AUG/GUGUGUAUC'a (/ ekson-intron sınırıdır) değiştirildi (Şekil 1B)14. Bu dizi değişiklikleri, endojen U1 snRNA ile 5'-splice bölgesi basepairing'in tahmin edilen desenini değiştirir ve ayrıca olgun transkriptte ekson 2'nin atlanmasına neden ol(Şekil 2). Bu mutasyonların etkisi U1 snRNA'nın 5'-bölgesinde telafi edici bir değişiklikle bastırılabilir. Urasilin U1 snRNA'nın (U1-5a) 5.
Dup51 ve Dup51p transkriptlerinin birleşmesi 32P-Dup3r kullanılarak primer uzantı ile veya Dup8f ve Dup3r oligonükleotidler kullanılarak yarı nicel RT-PCR ile izlenebilir (Şekil 1); sıraları Tablo 7'de verilmiştir. HeLa hücrelerinde ifade edildiğinde, Dup51 minigene, ekson 2'nin verimli bir şekilde birikdiği olgun tam uzunlukta transkripti ifade eder (Şekil 2A, B, şerit 1). Dup51p'deki 5'-splice bölgesi mutasyonları ekson 2 inklüzyonunun ~%95'ten ~%30'a düşürülmesi, daha kısa transkriptin oluşmasına yol açtı (şerit 5). Dup51p'nin U1-5a snRNA ile birlikte ifade edilmesi, exon 2 birleştirmeyi kurtarır ve tam uzunlukta transkript oluşumunu geri yükler (şerit 8). U1 (U1-WT) veya U1-5g varyantı wildtype ile ifade, Dup51p birleştirme üzerinde benzer bir etkiye sahip değildir (şerit 6 ve 7). U1-WT, U1-5g veya U1-5a ifade, Dup51 muhabirinin birleştirme düzenini de değiştirmez (şerit 2-4). Genel olarak, bu sonuçlar Dup51p transkriptlerinde ekson 2 birleştirmenin kurtarılmasının özellikle U1-5a snRNA'daki U>A mutasyonu nedeniyle olduğunu göstermektedir.
Transfected U1 snRNA'ların ekspresyonunun izlenmesi için astar uzantısı veya RT-qPCR uygulanabilir. U1-5a varyant transkriptlerinin astar uzantısı ile algılanmasının, U1 SnRNA'nın 5. konumundaki adenin yakınında 20 nükleotid uzunluğunda ve basepairs olan U17-26 oligonükleotidini kullanır (Şekil 3A). Sadece dATP varlığında, U17-26, 22 veya 23 nükleotid uzunluğunda ürün veren endojen wildtype U1 snRNA için 2-3 nükleotitlerin birleştirilmesine izin verir (Şekil 3B, şerit 1, 2, 5 ve 6). U1-5a ve U1-5g varyantları için uzatma, 21 nükleotid uzunluğunda bir ürün (şerit 3, 4, 7 ve 8) üreten tek bir adenozin ilavesi sonrasında sona erer. RT-qPCR tarafından yapılan analiz, U1 varyantının endojen wildtype snRNA üzerinde ekspresyonunda kat artışının tahmin edilmesine izin verir. Burada, U1'e özgü astar çiftleri, varyant snRNA'lara giren mutasyonlarla çakışma olmayacak şekilde tasarlanmıştır (Şekil 3A). U2 snRNA ekspresyona normale döndükten sonra transklümlü U1-WT ve U1-5g ve U1-5a varyantlarının endojen snRNA üzerinde 3-5 kat olarak ifade edildiği bulunmuştur (Şekil 3C). Endojen U1'in HeLa hücrelerinde hücre başına 106 kopyada bulunduğu tahmin edilmektedir15. Böylece, eksojen varyant snRNA'lar endojen U1 üzerinde ~3-5 kat olarak ifade edilir. U1-5a snRNA'nın ekson 2 dahilini ~% 95'e kurtarma yeteneği, eksojen varyant snRNA seviyelerinin nascent muhabir transkriptlerinin bir eklenmesi için yeterli olduğunu göstermektedir.
| Malzemeler | Bir Reaksiyon için Tutar |
| PNK Arabelleği (10x) | 2,0 μL |
| T4 Polinükleotid Kinaz (T4 PNK) (10.000 U/mL) | 1,0 μL |
| Oligonükleotid* (10 μM) | 10,0 μL |
| 32 P-ATP (10 mM) | 1,0 μL |
| H2O (DEPC tedavi edilir) | 6,0 μL |
| *Etiketleme işaretleyicileri için pBR322 DNA-MspI Digest veya Düşük Moleküler Ağırlık İşaretçisinin 0,5 μL'si kullanılır. | |
Tablo 1: Oligonükleotidlerin 32P etiketlemesi. 32P-ATP kullanarak 5′-32P etiketli astarın hazırlanması için reaksiyon.
| Malzemeler - Master Mix I | Bir Reaksiyon için Tutar |
| RNA ve H2O (DEPC tedavi edilir) | 6,55 μL |
| 32 P-Dup3r (2,5 μM) | 0,4 μL |
| dNTP (10 mM) | 0,5 μL |
| Malzemeler – Master Mix II | Bir Reaksiyon için Tutar |
| İlk Strand Arabelleği (5x) | 2,00 μL |
| RNaz inhibitörü (40 U/μL) | 0,25 μL |
| DTT (0,1 M) | 0,05 μL |
| Ters Transkriptaz (RT) (200U/μL) | 0,25 μL |
Tablo 2: 32P-Dup3r astar uzantısı. Astar uzatma ile ekli muhabir transkriptlerinin analizi için reaksiyon.
| Malzemeler - Master Mix I | Bir Reaksiyon için Tutar |
| RNA ve ddH2O (DEPC tedavi edilir) | 11,0 μL |
| Rastgele Heksamer (50 ng/μL) | 1,0 μL |
| dNTP (10 mM) | 1,0 μL |
| Malzemeler – Master Mix II | Bir Reaksiyon için Tutar |
| İlk Strand Arabelleği (5x) | 4,0 μL |
| RNaz inhibitörü (40 U/μL) | 1,0 μL |
| DTT (0,1 M) | 1,0 μL |
| Ters Transkriptaz (RT) (200U/μL) | 1,0 μL |
Tablo 3: cDNA Sentezi. Toplam RNA'dan cDNA sentezi için reaksiyon.
| Malzemeler | Bir Reaksiyon için Tutar |
| cDNA Şablonu (100 ng/μL) | 1,00 μL |
| İleri Astar (Dup8f) (10 μM) | 0,25 μL |
| Cy5 Ters Astar (Cy5-Dup3r) (10 μM) | 0,25 μL |
| dNTP (10 μM) | 0,25 μL |
| Taq Arabelleği (10x) | 1,25 μL |
| Taq DNA Polimeraz (5000 U/mL) | 0,25 μL |
| H2O (DEPC tedavi edilir) | 9,25 μL |
Tablo 4: Floresan RT-PCR. Cy5 etiketli astar kullanılarak RT-PCR tarafından birikmiş muhabir transkriptlerinin analizi için reaksiyon.
| Malzemeler | Bir Reaksiyon için Tutar |
| RNA ve H2O (DEPC tedavi edilir) | 4.325 μL |
| dATP (10 mM) | 0,375 μL |
| 32 P-U17-26-R oligo nükleotid* | 1.000 μL |
| Malzemeler – Master Mix | Bir Reaksiyon için Tutar |
| İlk Strand Arabelleği (5x) | 1,5 μL |
| RNaz inhibitörü (40 U/μL) | 0,1 μL |
| DTT (0,1 M) | 0,1 μL |
| Ters Transkriptaz (RT) (200U/μL) | 0,1 μL |
| *Seyreltilmiş RNA'ya 32P-U17-26-R oligonükleotidinin 10.000 CPM'si eklenmelidir (Adım 6.2.). | |
Tablo 5: 32P-U1-snRNA astar uzantısı. Astar uzantısına göre varyant U1 snRNA ekspresyonunun analizi için reaksiyon.
| Malzemeler | Bir Reaksiyon için Tutar |
| Gerçek Zamanlı PCR Karışımı | 10,0 μL |
| cDNA (0,2 ng/μL) | 5,0 μL |
| İleri Astar (10 μM) | 0,2 μL |
| Ters Astar (10 μM) | 0,2 μL |
| H2O (DEPC tedavi edilir) | 4,6 μL |
Tablo 6: Nicel RT-qPCR. RT-qPCR ile varyant U1 snRNA ekspresyonunun nicel analizi için reaksiyonlar.
| Oligo Adı | Sıra (5′ ila 3′) | Teknik |
| Dup8f | GACACCATGCATGGTGCACC | Floresan RT-PCR |
| Cy5-Dup3r | /5Cy5/AACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCC | Floresan RT-PCR |
| Dup3r | AACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCC | Astar Uzantısı |
| U17-26R | TGGTATCTCCCCTGCCAGGT | Astar Uzantısı |
| U1/17-39F | GGAGATACCATGATCACGAAGG | RT-qPCR |
| U1/58-80R | CATCCGGAGTGCAATGGATAAG | RT-qPCR |
| U2/8-19F | CTCGGCCTTTTGGCTAGATCA | RT-qPCR |
| U2/62-84R | TCCTCGGATAGAGGACGTATCA | RT-qPCR |
Tablo 7: Oligonükleotid astarları dizisi. Astar adlarının, dizilerin ve astarların kullanıldığı tekniğin listesi.
Şekil 1: Dup51 ve Dup51p Minigene Reporters. (A) Üç ekson/iki intron minigene muhabirlerinin şematik gösterimi, Dup51 ve Dup51p. Dup8f ve Dup3r'un sırasıyla 1 ve 3'teki eksonlardaki konumları belirtilir. (B) Dup51 ve Dup51p muhabir transkriptlerinin 5'-splice site dizileri ile U1 snRNA ve U1-5a varyantının temel olarak tahmin edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Spliced Reporter Transkriptlerinin Analizi. HeLa hücreleri, U1-WT, U1-5g veya U1-5a snRNA'lar için Dup51 veya Dup51p minigene plazmidleri ve pcDNA kontrolü veya pNS6U1 plazmidleri ile kotransmid edildi. (A) Dup51 ve Dup51p minigene transkriptlerinin birikmelerini gösteren 32P etiketli Dup3r astarlı astar uzatma analizi. mRNA ürünleri jel görüntüsünün solunda belirtilir. Tam uzunluktaki ürünün yüzdesi (± s.d., n = 3) iki mRNA izoformunun bant yoğunluklarından hesaplanmıştır ve aşağıdaki grafiklerde temsil edilmektedir. (B) Dup51 veya Dup51p minigene transkriptlerinin birleştirilmiş olduğunu gösteren HeLa hücrelerinden çıkarılan toplam RNA'dan hazırlanan cDNA üzerinde Dup8f ve Cy5-Dup3r astarları ile RT-PCR analizi. mRNA ürünleri jel görüntüsünün solunda belirtilir. Tam uzunluktaki ürünün yüzdesi (± s.d., n = 3) iki mRNA izoformunun bant yoğunluklarından hesaplanmıştır ve aşağıdaki grafiklerde temsil edilmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: U1-5a snRNA varyantının analizi. HeLa hücreleri, U1-WT, U1-5g veya U1-5a snRNA'lar için Dup51 veya Dup51p minigene plazmidleri ve pcDNA kontrolü veya pNS6U1 plazmidleri ile kotransmid edildi. (A) U1 snRNA dizisinin iki boyutlu gösterimi. U1 snRNA'nın astar uzatma analizi için kullanılan U17-26R astarın konumu kırmızı çizgi ile gösterilir. U1 snRNA'nın RT-qPCR'si için kullanılan U1/17-39F ve U1/58-80R astarların konumu mavi çizgilerle gösterilir. (B) U1 snRNA wildtype ve U1-5g ve U1-5a varyantlarının ekspresyonunu tespit etmek için 32P etiketli U17-26 ile astar uzatma analizi. U1-WT'den oluşan ürünlerin konumları ve snRNA'ların varyantları belirtilir. (C) Hela hücrelerindeki U1 snRNA ekspresyon düzeylerinin RT-qPCR analizi. U1-snRNA ifadesindeki kat değişimi pcDNA negatif kontrolüne göre hesaplandı ve U2-snRNA olarak normalleştirildi, U1'de kat değişimi (± s.d.; n = 3) grafiklendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Test, HeLa dışındaki hücre hatlarında birleştirme analizi için uyarlanabilir, ancak hücre konflüensi ve DNA miktarı gibi transeksiyon verimliliğini etkileyen faktörlerin optimize edilmesi gerekebilir. Muhabirden U1 yapı oranına, diğer hücre türlerinde gözlenen ifade düzeylerine bağlı olarak belirlenmesi gerekebilecek başka bir kritik parametredir. Çıkarılan RNA'nın kalitesi birleştirme analizi için kritik öneme sahiptir; bu nedenle, RNaz içermeyen su kullanımı ve RNase inaktivasyon ajanları ile yüzeylerin dekontaminasyonu şiddetle tavsiye edilir.
Muhabir transkriptlerinin primer uzatma veya floresan RT-PCR ile analizi benzer sonuçlar verir, bu nedenle ekson 2'nin olgun transkripte dahil edilmesindeki değişiklikleri izlemek için her iki teknik de kullanılabilir. Floresan PCR reaksiyonu, ilk RNA konsantrasyonuna bağlı olan amplifikasyonun üstel aşamasında durdurulmalı ve ölçülmelidir. Bu nedenle, burada açıklananlardan farklı transeksiyon koşullarına sahip tahliller için amplifikasyon döngülerinin sayısının belirlenmesi gerekebilir. Radyoaktif olmayan yapısı nedeniyle kullanım kolaylığı RT-PCR testinin bir avantajıdır. Radyoaktif etiketli astarlı astar uzantısı ekstra güvenlik önlemleri gerektirse de, düşük miktarda RNA'dan gelen sinyalleri algılayabilir. Astar uzantısının ve RT-PCR'nin düşük aktarım hızı bu tahlilin bir sınırlamasıdır.
U1 snRNP tamamlama tahlili birden fazla amaç için almıştır. 5'-splice bölgesi mutasyonlarının etkilerini tersine çevirmenin yanı sıra, gen susturma ve birleştirme mekanizmalarının incelenmesi için 5'-bölgede değişiklik taşıyan U1 snRNA'lar uygulanmıştır. Fortes ve ark. U1 snRNA'ların endojen transkriptlerin terminal eksonlarına hedef edilmesinin gen ekspresyonunun verimli bir şekilde inhibe olabileceğini göstermiştir16. Roca ve diğerleri. U1 tamamlayıcısını kullanarak 5'-splice alan tanımanın standart olmayan mekanizmalarını inceledi ve U1 snRNA'nın basepairing'in bir nükleotid tarafından kaydırıldığı alternatif bir kayıtta ve ayrıca mRNA öncesi veya snRNA17'de şişkin nükleotidlerin bulunduğu "şişkinlik kayıtlarında" 5'-splice bölgelerine dayanabileceğini gösterdi. 18. Bu muhabir sistemi potansiyel olarak U1 snRNP'nin küçük moleküller tarafından modülasyonun birlenmesinde ve düzenleyici proteinlerin birlenmesindeki rolünü incelemek için kullanılabilir. Dup51p'nin 2. Alternatif birleştirme faktörleri için düzenleyici dizileri eksonlara veya intronlara dahil ederek, birleştirme yönetmeliğinde U1 bağımlılığını incelemek mümkün olmalıdır. Bu kavram, U1 snRNA'nın kök döngü 4'ünin polipyrimidin sistem bağlayıcı protein 120 tarafından birleştirme regülasyonuna katılımını göstermek için Hamid ve ark. Bu tahlil, U1 snRNA'nın 3 ve 4.kök döngülerinin işlevlerini incelemek için kullandık. Dup51p birleştirme muhabirinde mutant 5'-splice bölgesini aktive eden baskılayıcı U1-5a snRNA'nın kök döngüsüne mutasyonları dahil ederek, spliceosome assembly14,21'in ilk adımlarında U2 snRNP spesifik protein SF3A1 ile çapraz intron temaslarının oluşumundaki kritik rollerini belirledik. Bu nedenle, üç eksonlu iki intron Dup51 muhabiri, spliceosome montajı ve birleştirme ile ilişkili hastalığın altında kalan mekanizmalar üzerinde yapılan çalışmalarda birleştirme verimliliğini izlemek için uyarlanabilir bir araç olarak hizmet vermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21CA170786 ve R01GM127464) ve Amerikan Kanser Derneği'nden (Kurumsal Araştırma Hibesi 74-001-34-IRG) ve Vadi Araştırma Ortaklığı Programı'ndan (P1-4009 ve VRP77) S.S. ve W.M.'ye fonlarla desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent Grade Deionized Water | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet | Gibco | 12100-046 | |
| Sodium Bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Disposable PES Bottle Top Filters | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% Trypsin (10x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| Transfection medium - Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection Reagent - Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glycogen (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Size exclusion beands - Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Size exclusion mini columns | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase inactivating reagents - RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Reverse Transcriptase - M-MLV Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 28025013 | used for primer extension |
| Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Random Hexamers (50 µM) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Real time PCR mix - SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080093 | used for cDNA preparation |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review Material Safety Data Sheets |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review Material Safety Data Sheets |
| Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Review Material Safety Data Sheets |
| Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems | ThermoFisher Scientific |
References
- Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S.
- Ward, A. J., Cooper, T. A.
- Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5' splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
- Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5'-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
- Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).
- Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).
- Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
- Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
- Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
- Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
- Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
- Steitz, J. A., et al. Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 115-154 (1988).
- Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5' end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
- Roca, X., et al. Widespread recognition of 5' splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
- Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5' splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
- Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
- Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
- Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).
