En reporterbaserad cellulär analys för övervakning av splitsningseffektivitet
Summary
Detta protokoll beskriver en minigene reporter analys för att övervaka effekten av 5’s-skarvning webbplats mutationer på skarvning och utvecklar suppressor U1 snRNA för räddning av mutation-inducerad splitsning hämning. Reportern och suppressorn U1 snRNA konstruktioner uttrycks i HeLa celler, och splitsning analyseras av primer förlängning eller RT-PCR.
Abstract
Under genuttryck innebär det avgörande steget i pre-mRNA splitsning korrekt erkännande av skarv platser och effektiv montering av spliceosomal komplex att sammanfoga exons och ta bort introner före cytoplasmic export av mogna mRNA. Splitsningseffektivitet kan ändras genom förekomsten av mutationer på skarvplatser, påverkan av transverkande splitsningsfaktorer eller aktiviteten hos terapeutiska. Här beskriver vi protokollet för en cellulär analys som kan tillämpas för övervakning av skarvningseffektiviteten hos en viss exon. Analysen använder en anpassningsbar plasmidkodad 3-exon/2-intron minigene reporter, som kan uttryckas i däggdjursceller genom transienta transfection. Efter transfektion isoleras totalt cellulärt RNA, och effektiviteten av exon splitsning i reporter mRNA bestäms av antingen primer förlängning eller semi-kvantitativ omvänd transkriptas-polymeras kedjereaktion (RT-PCR). Vi beskriver hur effekten av sjukdomen associerade 5 ′ skarv-webbplats mutationer kan bestämmas genom att införa dem i reportern; och hur undertryckandet av dessa mutationer kan uppnås genom samtransfektion med U1 små nukleära RNA (snRNA) konstruera bärande kompensatoriska mutationer i dess 5′ region som basepairs med 5′-skarv platser vid exon-intron korsningar i pre-mRNAs. Således kan reportern användas för design av terapeutiska U1 partiklar för att förbättra erkännandet av mutant 5 ′ skarv-platser. Införande av cis-verkande regleringsplatser, såsom splitsning förstärkare eller ljuddämpare sekvenser, i reportern kan också användas för att undersöka U1 snRNP: s roll i reglering förmedlas av en specifik alternativ skarvningsfaktor. Slutligen kan reporter uttrycker celler inkuberas med små molekyler för att bestämma effekten av potentiella terapier på konstituerande pre-mRNA splitsning eller på exoner som bär mutant 5 ′ skarv platser. Sammantaget kan reporteranalysen tillämpas för att övervaka skarvningseffektivitet i en mängd olika förhållanden för att studera grundläggande splitsningsmekanismer och skarvningsrelaterade sjukdomar.
Introduction
Pre-mRNA-skarvning är ett viktigt bearbetningssteg som tar bort icke-kodande introner och exakt ligates kodexoner för att bilda mogna mRNA. Erkännande av konsensussekvenser vid exon-intron-korsningar, så kallade 5′skarvplats och 3′skarvplats, av komponenter i skarvningsmaskineriet initierar skarvningsprocessen. U1 små nukleära ribonucleoprotein (snRNP) känner igen 5′-skarvplatsen genom basparning av U1 snRNA till pre-mRNA1. Genetiskt ärvda mutationer som ändrar 5′-skarv plats sekvenser är associerade med många sjukdomar2,3. det förutspås att förlusten av basepairing av U1 snRNA med mutanta 5′-skarv platser orsakar avvikande splitsning, vilket kan äventyra översättningen av den drabbade transkriptionen. En potentiell terapeutisk strategi för att korrigera splitsning defekter innebär undertryckande av mutationer genom modifierade U1 snRNA bär kompensatoriska nukleotid förändringar i sin 5′-region som basepairs med 5′-skarv webbplats. Sådana modifierade U1 snRNAs, även kallad exon specifika U1 snRNAs, har visat sig vara effektiva för att vända splitsning defekter, vilket resulterar i ökat proteinuttryck från den räddade mRNA4,5,6,7,8.
Här beskriver vi U1 snRNP komplementeringsanalys, en reporter-baserad cellulär skarvning analys som tillåter bedömning av effekten av 5′ss mutationer på skarvning av en exon och kan också användas för utveckling av modifierade U1 snRNAs för att möjliggöra räddning av exon inkludering. Vi tillhandahåller också protokoll för övervakning av de skarvade reporter transkriptioner av primer förlängning och RT-PCR, och för att bestämma uttrycket av modifierade U1 snRNAs genom primer förlängning och RT-qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analysen kan anpassas för skarvningsanalys i andra cellinjer än HeLa, men faktorer som påverkar transfekteringseffektiviteten, såsom cellkonfluens och mängden DNA kan behöva optimeras. Konstruktionsförhållandet reporter till U1 är en annan kritisk parameter som kan behöva bestämmas beroende på de uttrycksnivåer som observerats i andra celltyper. Kvaliteten på extraherat RNA är avgörande för skarvningsanalys; Därför rekommenderas starkt användning av RNase-fritt vatten och dekontaminering av ytor med R…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av medel till S.S. från National Institutes of Health (R21CA170786 och R01GM127464) och American Cancer Society (Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) och till S.S. och W.M. från Valley Research Partnership Program (P1-4009 och VRP77). Innehållet är endast författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health.
Materials
| Reagent Grade Deionized Water | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet | Gibco | 12100-046 | |
| Sodium Bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Disposable PES Bottle Top Filters | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% Trypsin (10x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| Transfection medium – Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection Reagent – Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glycogen (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Size exclusion beands – Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Size exclusion mini columns | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase inactivating reagents – RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 28025013 | used for primer extension |
| Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Random Hexamers (50 µM) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Real time PCR mix – SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080093 | used for cDNA preparation |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review Material Safety Data Sheets |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review Material Safety Data Sheets |
| Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Review Material Safety Data Sheets |
| Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems | ThermoFisher Scientific |
References
- Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5′ splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
- Ward, A. J., Cooper, T. A. The pathobiology of splicing. Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).
- Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5′ splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
- Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5′-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
- Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).
- Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).
- Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
- Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
- Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
- Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
- Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
- Steitz, J. A., et al. . Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , 115-154 (1988).
- Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5′ end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
- Roca, X., et al. Widespread recognition of 5′ splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
- Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5′ splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
- Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
- Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
- Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).
