Summary

Репортерный клеточный анализ для мониторинга эффективности сплайсинга

Published: September 15, 2021
doi:

Summary

Этот протокол описывает минигенный репортерный анализ для мониторинга влияния мутаций 5-образного сайта сращивания на сплайсинг и разрабатывает супрессор U1 snRNA для спасения ингибирования сплайсинга, вызванного мутациями. Конструкции репортера и супрессора U1 snRNA экспрессируются в клетках HeLa, а сплайсинг анализируется путем праймерного расширения или ОТ-ПЦР.

Abstract

Во время экспрессии генов жизненно важный этап сплайсинга пре-мРНК включает в себя точное распознавание участков сращивания и эффективную сборку сплайсеосомальных комплексов для соединения экзонов и удаления интронов до цитоплазматического экспорта зрелой мРНК. Эффективность сплайсинга может быть изменена наличием мутаций в местах сращивания, влиянием транс-действующих факторов сплайсинга или активностью терапевтических средств. Здесь мы описываем протокол для клеточного анализа, который может быть применен для мониторинга эффективности сплайсинга любого данного экзона. В анализе используется адаптируемый плазмидный закодированный 3-экзон/2-интронный минигенный репортер, который может быть экспрессирован в клетках млекопитающих путем транзиторной трансфекции. После трансфекции выделяют общую клеточную РНК, а эффективность сплайсинга экзонов в репортерной мРНК определяют либо расширением праймера, либо полуколичественной обратной транскриптазно-полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Мы описываем, как влияние связанных с заболеванием 5′ мутаций сращивания может быть определено путем введения их в репортер; и как подавление этих мутаций может быть достигнуто путем совместной трансфекции с конструкцией малой ядерной РНК (snRNA) U1, несущей компенсаторные мутации в ее 5′-области, которая базирует пары с 5′-сращивающимися участками на экзон-интронных переходах в премРНК. Таким образом, репортер может быть использован для проектирования терапевтических частиц U1 для улучшения распознавания мутантных 5′ сращивающихся сайтов. Вставка цис-действующих регуляторных сайтов, таких как последовательности усилителя сращивания или глушителя, в репортер также может быть использована для изучения роли U1 snRNP в регулировании, опосредованном конкретным альтернативным фактором сплайсинга. Наконец, репортерные экспрессирующие клетки могут быть инкубированы с небольшими молекулами для определения влияния потенциальных терапевтических средств на конститутивное сплайсинг пре-мРНК или на экзоны, несущие мутантные 5′ места сращивания. В целом, репортерный анализ может быть применен для мониторинга эффективности сплайсинга в различных условиях для изучения фундаментальных механизмов сплайсинга и заболеваний, связанных со сплайсингом.

Introduction

Сплайсинг пре-мРНК является важным этапом обработки, который удаляет некодирующие интроны и точно кодирует кодирующие экзоны для формирования зрелой мРНК. Распознавание консенсусных последовательностей на экзон-интронных переходах, называемых 5-сращивающим участком и 3-сращивающим участком, компонентами сращивающего механизма инициирует процесс сращивания. Малый ядерный рибонуклеопротеин U1 (snRNP) распознает сайт 5-сращивания путем спаривания основания snRNA U1 с пре-mRNA1. Генетически унаследованные мутации, которые изменяют последовательности 5-сращивания, связаны со многими заболеваниями2,3. Прогнозируется, что потеря парировки основания snRNA U1 с мутантными 5-сращивающими сайтами вызывает аберрантное сплайсинг, что может поставить под угрозу трансляцию пораженного транскрипта. Потенциальный терапевтический подход к исправлению дефектов сплайсинга включает подавление мутаций модифицированной U1 snRNA, несущей компенсаторные нуклеотидные изменения в своей 5-области, которая имеет основания с 5-сращенным участком. Было обнаружено, что такие модифицированные U1 snRNAs, также называемые экзон-специфическими U1 snRNAs, эффективны в обращении вспять дефектов сплайсинга, что приводит к увеличению экспрессии белка из спасенной мРНК4,5,6,7,8.

Здесь мы описываем анализ комплементации U1 snRNP, основанный на репортерах клеточный сплайсинг, который позволяет оценить влияние мутаций 5’ss на сплайсинг экзона, а также может быть использован для разработки модифицированных U1 snRNAs для спасения включения экзонов. Мы также предоставляем протоколы для мониторинга сращенных репортерных транскриптов с помощью праймерного расширения и ОТ-ПЦР, а также для определения экспрессии модифицированных snRNAs U1 с помощью праймерного расширения и RT-qPCR.

Protocol

1. Реагенты и буферы ПРИМЕЧАНИЕ: Вся стерилизация с использованием вакуумных фильтров должна выполняться с мембраной 0,2 мкм полиэфирсульфона (PES) в шкафу биобезопасности. Приготовьте воду без РНКазы, добавив 1,0 мл диэтилпирокарбоната (DEPC) к 1,0 л деионизированной воды, …

Representative Results

Сплайсинг-репортер Dup51, миниген из трех экзонов-двух интронов, был получен из гена β-глобина человека и был описан ранее (рисунок 1A)11,12. Мы создали мутантный репортер Dup51p, введя мутации сайта 5′-сращивания, связанные с синдромом Ашера, которы?…

Discussion

Анализ может быть адаптирован для анализа сплайсинга в клеточных линиях, отличных от HeLa, однако факторы, влияющие на эффективность трансфекции, такие как клеточная конфузия и количество ДНК, возможно, потребуется оптимизировать. Отношение репортера к конструкции U1 является еще одним к…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана фондами S.S. от Национальных институтов здравоохранения (R21CA170786 и R01GM127464) и Американского онкологического общества (грант на институциональные исследования 74-001-34-IRG), а также S.S. и W.M. от Valley Research Partnership Program (P1-4009 и VRP77). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Materials

Reagent Grade Deionized Water ThermoFisher Scientific 23-751628
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758-25ML
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet Gibco 12100-046
Sodium Bicarbonate ThermoFisher Scientific S233-500
Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated Omega Scientific FB-22
Penicillin-Streptomycin (P/S) Sigma-Aldrich P4458-100ML
Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N Sigma-Aldrich S2567-16A
Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% ThermoFisher Scientific A144-500
Disposable PES Bottle Top Filters ThermoFisher Scientific FB12566510
EDTA Disodium Salt Dihydrate Amresco 0105-2.5KG
2.5% Trypsin (10x), no phenol red ThermoFisher Scientific 15090046
Sodium Chloride Fisher Bioreagent BP358-212
Potassium Chloride Fisher Bioreagent BP366-1
Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate Fisher Bioreagent BP332-1
Potassium Dihydrogen Phosphate Fisher Bioreagent BP362-1
Transfection medium – Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red ThermoFisher Scientific 11058021
Transfection Reagent – Lipofectamine™ 2000 ThermoFisher Scientific 13778150
TRIzol™ Reagent ThermoFisher Scientific 15596018
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) ThermoFisher Scientific BP1145-1
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents ThermoFisher Scientific BP2818-4
Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents ThermoFisher Scientific BP2618-212
Glycogen (5 mg/ml) ThermoFisher Scientific AM9510
Direct-zol RNA Miniprep Kit Zymo Research R2052
ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi PerkinElmer NEG035C001MC
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L
Size exclusion beands – Sephadex® G-25 Sigma-Aldrich G2580-10G
Size exclusion mini columns USA Scientific 1415-0600
pBR322 DNA-MspI Digest New England Biolabs N3032S
Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt Affymetrix 76410 100 UL
Rnase inactivating reagents – RNaseZAP™ Sigma-Aldrich R2020-250ML
dNTP Mix (10 mM ea) ThermoFisher Scientific 18427013
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor ThermoFisher Scientific 10777019
Reverse Transcriptase – M-MLV Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific 28025013 used for primer extension
Taq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific 10342020
Random Hexamers (50 µM) ThermoFisher Scientific N8080127
Real time PCR mix – SYBR™ Select Master Mix ThermoFisher Scientific 4472903
SuperScript™ III Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific 18080093 used for cDNA preparation
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher Scientific 18080093
5X First-Strand Buffer ThermoFisher Scientific 18080093
Formamide (≥99.5%) ThermoFisher Scientific BP228-100 Review Material Safety Data Sheets
Bromophenol Blue sodium salt Sigma-Aldrich 114405-5G
Xylene Cyanol FF Sigma-Aldrich 2650-17-1
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) ThermoFisher Scientific BP152-5
Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) ThermoFisher Scientific BP168-500
Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) ThermoFisher Scientific BP1406-1 Review Material Safety Data Sheets
Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) ThermoFisher Scientific BP169-212
Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade VWR M133-25G
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-100ML
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure VWR 0761-25ML Review Material Safety Data Sheets
Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon VWR ASG-400
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm VWR NGP-125NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm VWR NGP-200NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm VWR NGP-400NR
GE Storage Phosphor Screens Sigma-Aldrich GE28-9564
Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager GE Healthcare 28-9610-73 AB
Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter GMI 8043-30-1194
C1000 Touch Thermal Cycler ThermoFisher Scientific
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems ThermoFisher Scientific

References

  1. Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5′ splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
  2. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
  3. Ward, A. J., Cooper, T. A. The pathobiology of splicing. Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).
  4. Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5′ splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
  5. Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5′-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
  6. Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).
  7. Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).
  8. Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
  9. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
  10. Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
  11. Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
  12. Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
  13. Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
  14. Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
  15. Steitz, J. A., et al. . Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , 115-154 (1988).
  16. Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5′ end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
  17. Roca, X., et al. Widespread recognition of 5′ splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
  18. Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5′ splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
  19. Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
  20. Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
  21. Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).

Play Video

Cite This Article
Wong, J., Martelly, W., Sharma, S. A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency. J. Vis. Exp. (175), e63014, doi:10.3791/63014 (2021).

View Video