Summary

Een op reporter gebaseerde cellulaire test voor het bewaken van splicing-efficiëntie

Published: September 15, 2021
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft een minigene reporter assay om de impact van 5′-splice site mutaties op splicing te monitoren en ontwikkelt suppressor U1 snRNA voor de redding van mutatie-geïnduceerde splicing remming. De reporter en suppressor U1 snRNA constructen worden uitgedrukt in HeLa cellen, en splicing wordt geanalyseerd door primer extensie of RT-PCR.

Abstract

Tijdens genexpressie omvat de vitale stap van pre-mRNA-splicing nauwkeurige herkenning van spliceplaatsen en efficiënte assemblage van spliceosomale complexen om exonen te verenigen en introns te verwijderen voorafgaand aan cytoplasmatische export van het volwassen mRNA. De splicingefficiëntie kan worden gewijzigd door de aanwezigheid van mutaties op spliceplaatsen, de invloed van trans-acterende splicingfactoren of de activiteit van therapeutica. Hier beschrijven we het protocol voor een cellulaire assay die kan worden toegepast voor het bewaken van de splicing-efficiëntie van een bepaald exon. De test maakt gebruik van een aanpasbare plasmide gecodeerde 3-exon / 2-intron minigene reporter, die kan worden uitgedrukt in zoogdiercellen door voorbijgaande transfectie. Posttransfectie wordt totaal cellulair RNA geïsoleerd en de efficiëntie van exon splicing in het reporter mRNA wordt bepaald door primer extension of semi-kwantitatieve reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). We beschrijven hoe de impact van ziekte geassocieerde 5′ splice-site mutaties kan worden bepaald door ze in de reporter te introduceren; en hoe de onderdrukking van deze mutaties kan worden bereikt door co-transfectie met U1 klein nucleair RNA (snRNA) construct met compenserende mutaties in zijn 5 ′-regio die basepairs met de 5′-splice sites op exon-intron juncties in pre-mRNA’s. Zo kan de reporter worden gebruikt voor het ontwerpen van therapeutische U1-deeltjes om de herkenning van mutante 5′splice-sites te verbeteren. Het invoegen van cis-acterende regulerende sites, zoals splicing enhancer of silencer sequences, in de reporter kan ook worden gebruikt om de rol van U1 snRNP in regulatie te onderzoeken, gemedieerd door een specifieke alternatieve splicingfactor. Ten slotte kunnen reporter-expressiecellen worden geïncubeerd met kleine moleculen om het effect van potentiële therapieën op constitutieve pre-mRNA-splicing of op exonen met mutante 5′-spliceplaatsen te bepalen. Over het algemeen kan de reporter-test worden toegepast om de splicing-efficiëntie in verschillende omstandigheden te controleren om fundamentele splicing-mechanismen en splicing-geassocieerde ziekten te bestuderen.

Introduction

Pre-mRNA splicing is een essentiële verwerkingsstap die niet-coderende introns verwijdert en nauwkeurig coderende exonen bindt om volwassen mRNA te vormen. Herkenning van consensussequenties op exon-intron juncties, aangeduid als 5-splice site en 3-splice site, door componenten van de splicing machinerie initieert het splicing proces. Het U1 kleine nucleaire ribonucleoproteïne (snRNP) herkent de 5-splice site door base paring van het U1 snRNA aan het pre-mRNA1. Genetisch overgeërfde mutaties die 5-splice site sequences veranderen, zijn geassocieerd met vele ziekten2,3. Er wordt voorspeld dat het verlies van basepairing van U1-snRNA met de mutante 5-splice-sites afwijkende splicing veroorzaakt, wat de vertaling van het aangetaste transcript in gevaar kan brengen. Een mogelijke therapeutische benadering om de splicingdefecten te corrigeren, omvat onderdrukking van mutaties door gemodificeerd U1-snRNA met compenserende nucleotideveranderingen in het 5-gebied dat basepairs met de 5-spliceplaats. Dergelijke gemodificeerde U1-snRNA’s, ook wel exonspecifieke U1-snRNA’s genoemd, zijn effectief gebleken bij het omkeren van splicingdefecten, wat resulteert in verhoogde eiwitexpressie van het geredde mRNA4,5,6,7,8.

Hier beschrijven we de U1 snRNP-complementatietest, een op reporter gebaseerde cellulaire splicing-assay die een beoordeling mogelijk maakt van het effect van 5-ss-mutaties op splicing van een exon en ook kan worden gebruikt voor de ontwikkeling van gemodificeerde U1-snRNA’s om de redding van exon-inclusie mogelijk te maken. We bieden ook protocollen voor het monitoren van de gesplitste reporter transcripties door primer extensie en RT-PCR, en voor het bepalen van de expressie van gemodificeerde U1 snRNA’s door primer extensie en RT-qPCR.

Protocol

1. Reagentia en buffers OPMERKING: Alle sterilisatie met behulp van vacuümfilters moet worden uitgevoerd met 0,2 μm polyethersulfon (PES) membraan in een bioveiligheidskast. Bereid RNase-vrij water door 1,0 ml diethylpyrocarbonaat (DEPC) toe te voegen aan 1,0 l gedeïoniseerd water, meng gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur (RT), autoclaaf tweemaal en koel vervolgens af tot RT voor gebruik. Bereid Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) voor door één pak DMEM…

Representative Results

De splicing reporter Dup51, een drie exon-twee intron minigen, is afgeleid van het menselijke β-globine gen en is eerder beschreven (Figuur 1A)11,12 . We creëerden een mutante reporter, Dup51p, door ushersyndroom geassocieerde 5′-splice site mutaties te introduceren die voorkomen in exon 3 van het protocadherine 15 (PCDH15) gen13. De 5′-splice site sequence op de exon 2-intron 2 junctie werd verande…

Discussion

De test kan worden aangepast voor splicinganalyse in andere cellijnen dan HeLa, maar factoren die van invloed zijn op de transfectie-efficiëntie, zoals celconfluentie en hoeveelheid DNA, moeten mogelijk worden geoptimaliseerd. De reporter-U1-constructverhouding is een andere kritische parameter die mogelijk moet worden bepaald, afhankelijk van de expressieniveaus die in andere celtypen worden waargenomen. De kwaliteit van geëxtraheerd RNA is van cruciaal belang voor splicinganalyse; daarom wordt het gebruik van RNase-v…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door fondsen aan S.S. van de National Institutes of Health (R21CA170786 en R01GM127464) en de American Cancer Society (de Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) en aan S.S. en W.M. van het Valley Research Partnership Program (P1-4009 en VRP77). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Materials

Reagent Grade Deionized Water ThermoFisher Scientific 23-751628
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758-25ML
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet Gibco 12100-046
Sodium Bicarbonate ThermoFisher Scientific S233-500
Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated Omega Scientific FB-22
Penicillin-Streptomycin (P/S) Sigma-Aldrich P4458-100ML
Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N Sigma-Aldrich S2567-16A
Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% ThermoFisher Scientific A144-500
Disposable PES Bottle Top Filters ThermoFisher Scientific FB12566510
EDTA Disodium Salt Dihydrate Amresco 0105-2.5KG
2.5% Trypsin (10x), no phenol red ThermoFisher Scientific 15090046
Sodium Chloride Fisher Bioreagent BP358-212
Potassium Chloride Fisher Bioreagent BP366-1
Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate Fisher Bioreagent BP332-1
Potassium Dihydrogen Phosphate Fisher Bioreagent BP362-1
Transfection medium – Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red ThermoFisher Scientific 11058021
Transfection Reagent – Lipofectamine™ 2000 ThermoFisher Scientific 13778150
TRIzol™ Reagent ThermoFisher Scientific 15596018
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) ThermoFisher Scientific BP1145-1
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents ThermoFisher Scientific BP2818-4
Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents ThermoFisher Scientific BP2618-212
Glycogen (5 mg/ml) ThermoFisher Scientific AM9510
Direct-zol RNA Miniprep Kit Zymo Research R2052
ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi PerkinElmer NEG035C001MC
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L
Size exclusion beands – Sephadex® G-25 Sigma-Aldrich G2580-10G
Size exclusion mini columns USA Scientific 1415-0600
pBR322 DNA-MspI Digest New England Biolabs N3032S
Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt Affymetrix 76410 100 UL
Rnase inactivating reagents – RNaseZAP™ Sigma-Aldrich R2020-250ML
dNTP Mix (10 mM ea) ThermoFisher Scientific 18427013
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor ThermoFisher Scientific 10777019
Reverse Transcriptase – M-MLV Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific 28025013 used for primer extension
Taq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific 10342020
Random Hexamers (50 µM) ThermoFisher Scientific N8080127
Real time PCR mix – SYBR™ Select Master Mix ThermoFisher Scientific 4472903
SuperScript™ III Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific 18080093 used for cDNA preparation
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher Scientific 18080093
5X First-Strand Buffer ThermoFisher Scientific 18080093
Formamide (≥99.5%) ThermoFisher Scientific BP228-100 Review Material Safety Data Sheets
Bromophenol Blue sodium salt Sigma-Aldrich 114405-5G
Xylene Cyanol FF Sigma-Aldrich 2650-17-1
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) ThermoFisher Scientific BP152-5
Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) ThermoFisher Scientific BP168-500
Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) ThermoFisher Scientific BP1406-1 Review Material Safety Data Sheets
Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) ThermoFisher Scientific BP169-212
Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade VWR M133-25G
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-100ML
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure VWR 0761-25ML Review Material Safety Data Sheets
Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon VWR ASG-400
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm VWR NGP-125NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm VWR NGP-200NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm VWR NGP-400NR
GE Storage Phosphor Screens Sigma-Aldrich GE28-9564
Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager GE Healthcare 28-9610-73 AB
Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter GMI 8043-30-1194
C1000 Touch Thermal Cycler ThermoFisher Scientific
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems ThermoFisher Scientific

References

  1. Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5′ splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
  2. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
  3. Ward, A. J., Cooper, T. A. The pathobiology of splicing. Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).
  4. Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5′ splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
  5. Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5′-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
  6. Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).
  7. Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).
  8. Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
  9. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
  10. Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
  11. Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
  12. Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
  13. Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
  14. Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
  15. Steitz, J. A., et al. . Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , 115-154 (1988).
  16. Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5′ end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
  17. Roca, X., et al. Widespread recognition of 5′ splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
  18. Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5′ splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
  19. Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
  20. Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
  21. Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).

Play Video

Cite This Article
Wong, J., Martelly, W., Sharma, S. A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency. J. Vis. Exp. (175), e63014, doi:10.3791/63014 (2021).

View Video