Summary

スプライシング効率を監視するためのレポーターベースの細胞アッセイ

Published: September 15, 2021
doi:

Summary

このプロトコルは、スプライシングに対する5′-スプライス部位変異の影響をモニターするためのミニジーンレポーターアッセイを記述し、変異誘発スプライシング阻害のレスキューのためのサプレッサーU1 snRNAを開発する。レポーターおよびサプレッサーU1 snRNA構築物をHeLa細胞で発現させ、スプライシングをプライマー伸長またはRT-PCRによって分析する。

Abstract

遺伝子発現中、プレmRNAスプライシングの重要なステップは、スプライス部位の正確な認識と、成熟mRNAの細胞質的輸出前にエクソンを結合し、イントロンを除去するためのスプライソソーム複合体の効率的な組み立てを含む。スプライシング効率は、スプライス部位における変異の存在、トランス作用型スプライシング因子の影響、または治療薬の活性によって変化させることができる。ここで、任意の所与のエクソンのスプライシング効率をモニターするために適用することができる細胞アッセイのためのプロトコルを記載する。アッセイは、3-エクソン/2-イントロンミニジーンレポーターにコードされる適応性プラスミドを使用し、これは一過性トランスフェクションによって哺乳動物細胞で発現させることができる。トランスフェクション後、全細胞RNAが単離され、レポーターmRNAにおけるエクソンスプライシングの効率は、プライマー伸長または半定量的逆転写酵素 – ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)のいずれかによって決定される。我々は、5’スプライス部位変異に関連する疾患の影響が、レポーターにそれらを導入することによってどのように決定され得るかを記述します。これらの変異の抑制が、プレmRNAのエキソン-イントロン接合部の5′-スプライス部位と塩基対する5’領域に代償性変異を有するU1小型核RNA(snRNA)構築物との同時トランスフェクションによって達成され得る方法。したがって、レポーターは、変異体5’スプライス部位の認識を改善するための治療用U1粒子の設計に使用することができる。スプライシングエンハンサーまたはサイレンサー配列などの シス作用調節部位のレポーターへの挿入は、特定の選択的スプライシング因子によって媒介される調節におけるU1 snRNPの役割を調べるためにも使用され得る。最後に、レポーター発現細胞を小分子と共にインキュベートして、構成的プレmRNAスプライシングまたは変異体5’スプライス部位を有するエクソンに対する潜在的な治療薬の効果を決定することができる。全体として、レポーターアッセイは、基本的なスプライシングメカニズムおよびスプライシング関連疾患を研究するために、様々な条件下でのスプライシング効率をモニターするために適用することができる。

Introduction

プレmRNAスプライシングは、非コードイントロンを除去し、コードエクソンを正確にライゲーションして成熟mRNAを形成する重要なプロセシングステップです。5′-スプライス部位および3-スプライス部位と呼ばれるエクソン-イントロン接合部におけるコンセンサス配列の認識は、スプライシング機構の構成要素によって開始される。U1小核リボヌクレオタンパク質(snRNP)は、U1 snRNAとプレmRNA1との塩基対形成によって5-スプライス部位を認識する。5スプライス部位配列を変化させる遺伝的に遺伝する変異は、多くの疾患と関連している2,3。U1 snRNAと変異型5スプライス部位との塩基対形成が失われると、異常なスプライシングが発生し、影響を受ける転写産物の翻訳が損なわれる可能性があると予測されています。スプライシング欠損を補正するための潜在的な治療的アプローチは、5-スプライス部位と塩基対するその5-領域に代償性ヌクレオチド変化を有する修飾U1 snRNAによる変異の抑制を含む。エクソン特異的U1 snRNAとも呼ばれるこのような修飾U1 snRNAは、スプライシング欠陥を逆転させるのに有効であり、救助されたmRNA45678からのタンパク質発現の増加をもたらすことが見出されている。

ここでは、エクソンのスプライシングに対する5-ss変異の効果の評価を可能にし、エクソンインクルージョンのレスキューを可能にする修飾U1 snRNAの開発にも使用できるレポーターベースの細胞スプライシングアッセイであるU1 snRNP相補アッセイについて説明します。また、プライマー伸長およびRT-PCRによるスプライシングされたレポーター転写産物のモニタリング、およびプライマー伸長およびRT-qPCRによる修飾U1 snRNAの発現を決定するためのプロトコルも提供しています。

Protocol

1. 試薬およびバッファー 注:真空フィルターを使用した滅菌はすべて、バイオセーフティキャビネット内の0.2μmポリエーテルスルホン(PES)膜で行う必要があります。 1.0Lの脱イオン水にジエチルピロカーボネート(DEPC)1.0mLを加えてRNase非含有水を調製し、室温(RT)で少なくとも1時間混合し、オートクレーブを2回、次いでRTに冷却してから使用前にRTに冷却する。 <l…

Representative Results

スプライシングレポーターDup51は、3つのエクソン−2イントロンミニ遺伝子であり、ヒトβグロビン遺伝子に由来し、以前に記載した(図1A)11、12。我々は、プロトカドヘリン15(PCDH15)遺伝子のエクソン3に生じる5′-スプライス部位変異に関連するアッシャー症候群を導入することにより、変異レポーターDup51pを?…

Discussion

このアッセイは、HeLa以外の細胞株におけるスプライシング分析に適合させることができますが、細胞のコンフルエンシーやDNAの量など、トランスフェクション効率に影響を与える要因を最適化する必要がある場合があります。レポーター対U1構築物比は、他の細胞型で観察される発現レベルに応じて決定する必要があるかもしれない別の重要なパラメータである。抽出されたRNAの品質は、ス?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、国立衛生研究所(R21CA170786およびR01GM127464)および米国癌協会(Institutional Research Grant 74-001-34-IRG)からのS.S.およびW..Mへの資金と、Valley Research Partnership Program(P1-4009およびVRP77)からのS.S.およびW.への資金によって支援された。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

Materials

Reagent Grade Deionized Water ThermoFisher Scientific 23-751628
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich D5758-25ML
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet Gibco 12100-046
Sodium Bicarbonate ThermoFisher Scientific S233-500
Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated Omega Scientific FB-22
Penicillin-Streptomycin (P/S) Sigma-Aldrich P4458-100ML
Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N Sigma-Aldrich S2567-16A
Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% ThermoFisher Scientific A144-500
Disposable PES Bottle Top Filters ThermoFisher Scientific FB12566510
EDTA Disodium Salt Dihydrate Amresco 0105-2.5KG
2.5% Trypsin (10x), no phenol red ThermoFisher Scientific 15090046
Sodium Chloride Fisher Bioreagent BP358-212
Potassium Chloride Fisher Bioreagent BP366-1
Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate Fisher Bioreagent BP332-1
Potassium Dihydrogen Phosphate Fisher Bioreagent BP362-1
Transfection medium – Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red ThermoFisher Scientific 11058021
Transfection Reagent – Lipofectamine™ 2000 ThermoFisher Scientific 13778150
TRIzol™ Reagent ThermoFisher Scientific 15596018
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) ThermoFisher Scientific BP1145-1
Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents ThermoFisher Scientific BP2818-4
Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents ThermoFisher Scientific BP2618-212
Glycogen (5 mg/ml) ThermoFisher Scientific AM9510
Direct-zol RNA Miniprep Kit Zymo Research R2052
ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi PerkinElmer NEG035C001MC
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L
Size exclusion beands – Sephadex® G-25 Sigma-Aldrich G2580-10G
Size exclusion mini columns USA Scientific 1415-0600
pBR322 DNA-MspI Digest New England Biolabs N3032S
Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt Affymetrix 76410 100 UL
Rnase inactivating reagents – RNaseZAP™ Sigma-Aldrich R2020-250ML
dNTP Mix (10 mM ea) ThermoFisher Scientific 18427013
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor ThermoFisher Scientific 10777019
Reverse Transcriptase – M-MLV Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific 28025013 used for primer extension
Taq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific 10342020
Random Hexamers (50 µM) ThermoFisher Scientific N8080127
Real time PCR mix – SYBR™ Select Master Mix ThermoFisher Scientific 4472903
SuperScript™ III Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific 18080093 used for cDNA preparation
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher Scientific 18080093
5X First-Strand Buffer ThermoFisher Scientific 18080093
Formamide (≥99.5%) ThermoFisher Scientific BP228-100 Review Material Safety Data Sheets
Bromophenol Blue sodium salt Sigma-Aldrich 114405-5G
Xylene Cyanol FF Sigma-Aldrich 2650-17-1
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) ThermoFisher Scientific BP152-5
Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) ThermoFisher Scientific BP168-500
Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) ThermoFisher Scientific BP1406-1 Review Material Safety Data Sheets
Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) ThermoFisher Scientific BP169-212
Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade VWR M133-25G
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-100ML
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure VWR 0761-25ML Review Material Safety Data Sheets
Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon VWR ASG-400
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm VWR NGP-125NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm VWR NGP-200NR
Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm VWR NGP-400NR
GE Storage Phosphor Screens Sigma-Aldrich GE28-9564
Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager GE Healthcare 28-9610-73 AB
Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter GMI 8043-30-1194
C1000 Touch Thermal Cycler ThermoFisher Scientific
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems ThermoFisher Scientific

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Cite This Article
Wong, J., Martelly, W., Sharma, S. A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency. J. Vis. Exp. (175), e63014, doi:10.3791/63014 (2021).

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