Ein reporterbasierter zellulärer Assay zur Überwachung der Spleißeffizienz
Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen Minigene-Reporter-Assay zur Überwachung der Auswirkungen von 5′-Spleißstellenmutationen auf das Spleißen und entwickelt Suppressor U1 snRNA zur Rettung der mutationsinduzierten Spleißhemmung. Die Reporter- und Suppressor-U1-snRNA-Konstrukte werden in HeLa-Zellen exprimiert, und das Spleißen wird durch Primer-Extension oder RT-PCR analysiert.
Abstract
Während der Genexpression beinhaltet der entscheidende Schritt des Pre-mRNA-Spleißens die genaue Erkennung von Spleißstellen und die effiziente Montage von spleißosomalen Komplexen, um Exons zu verbinden und Introns vor dem zytoplasmatischen Export der reifen mRNA zu entfernen. Die Spleißeffizienz kann durch das Vorhandensein von Mutationen an Spleißstellen, den Einfluss transaktiver Spleißfaktoren oder die Aktivität von Therapeutika verändert werden. Hier beschreiben wir das Protokoll für einen zellulären Assay, der zur Überwachung der Spleißeffizienz eines bestimmten Exons angewendet werden kann. Der Assay verwendet einen anpassungsfähigen Plasmid-kodierten 3-Exon/2-Intron-Minigen-Reporter, der in Säugetierzellen durch transiente Transfektion exprimiert werden kann. Nach der Transfektion wird die gesamte zelluläre RNA isoliert, und die Effizienz des Exon-Spleißens in der Reporter-mRNA wird entweder durch Primer-Extension oder semi-quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) bestimmt. Wir beschreiben, wie die Auswirkungen von krankheitsassoziierten 5′-Spleißstellenmutationen bestimmt werden können, indem sie in den Reporter eingeführt werden; und wie die Unterdrückung dieser Mutationen durch Co-Transfektion mit einem U1-Konstrukt für kleine kernare RNA (snRNA) erreicht werden kann, das kompensatorische Mutationen in seiner 5′-Region trägt, die mit den 5′-Spleißstellen an Exon-Intron-Verbindungen in prä-mRNAs übereinstimmt. Somit kann der Reporter für das Design therapeutischer U1-Partikel verwendet werden, um die Erkennung von mutierten 5′-Spleißstellen zu verbessern. Das Einfügen von cis-wirkenden regulatorischen Stellen, wie Spleißverstärker- oder Schalldämpfersequenzen, in den Reporter kann auch verwendet werden, um die Rolle von U1 snRNP in der Regulierung zu untersuchen, die durch einen bestimmten alternativen Spleißfaktor vermittelt wird. Schließlich können Reporter-exprimierende Zellen mit kleinen Molekülen inkubiert werden, um die Wirkung potenzieller Therapeutika auf konstitutives prä-mRNA-Spleißen oder auf Exons mit mutierten 5′-Spleißstellen zu bestimmen. Insgesamt kann der Reporter-Assay angewendet werden, um die Spleißeffizienz unter einer Vielzahl von Bedingungen zu überwachen, um grundlegende Spleißmechanismen und Spleiß-assoziierte Krankheiten zu untersuchen.
Introduction
Pre-mRNA-Spleißen ist ein wesentlicher Verarbeitungsschritt, der nicht-kodierende Introns entfernt und exakt Ligaten kodiert, die Exons kodieren, um reife mRNA zu bilden. Die Erkennung von Konsenssequenzen an Exon-Intron-Übergängen, die als 5′-Spleißstelle und 3′-Spleißstelle bezeichnet werden, durch Komponenten der Spleißmaschinerie leitet den Spleißprozess ein. Das U1 Small Nuclear Ribonucleoprotein (snRNP) erkennt die 5′-Spleißstelle durch Basenpaarung der U1-snRNA zur prä-mRNA1. Genetisch vererbte Mutationen, die 5′-Spleißstellensequenzen verändern, sind mit vielen Krankheiten assoziiert2,3. Es wird vorhergesagt, dass der Verlust des Basepairings von U1-snRNA mit den mutierten 5‘-Spleißstellen ein aberrantes Spleißen verursacht, das die Translation des betroffenen Transkripts beeinträchtigen kann. Ein potenzieller therapeutischer Ansatz zur Korrektur der Spleißdefekte beinhaltet die Unterdrückung von Mutationen durch modifizierte U1-snRNA, die kompensatorische Nukleotidänderungen in ihrer 5‘-Region trägt, die mit der 5‘-Spleißstelle übereinstimmt. Solche modifizierten U1-snRNAs, auch als exonspezifische U1-snRNAs bezeichnet, haben sich als wirksam bei der Umkehrung von Spleißdefekten erwiesen, was zu einer erhöhten Proteinexpression aus der geretteten mRNA4,5,6,7,8 führt.
Hier beschreiben wir den U1 snRNP-Komplementierungsassay, einen reporterbasierten zellulären Spleißassay, der die Beurteilung der Wirkung von 5′-ss-Mutationen auf das Spleißen eines Exons ermöglicht und auch für die Entwicklung modifizierter U1-snRNAs verwendet werden kann, um die Rettung des Exon-Einschlusses zu ermöglichen. Wir bieten auch Protokolle zur Überwachung der gespleißten Reportertranskripte durch Primer-Erweiterung und RT-PCR und zur Bestimmung der Expression von modifizierten U1-snRNAs durch Primer-Erweiterung und RT-qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Assay kann für die Spleißanalyse in anderen Zelllinien als HeLa angepasst werden, jedoch müssen Faktoren, die die Transfektionseffizienz beeinflussen, wie Zellkonfluenz und DNA-Menge, möglicherweise optimiert werden. Das Konstruktverhältnis von Reporter zu U1 ist ein weiterer kritischer Parameter, der möglicherweise in Abhängigkeit von den in anderen Zelltypen beobachteten Expressionsniveaus bestimmt werden muss. Die Qualität der extrahierten RNA ist entscheidend für die Spleißanalyse; Daher wird die Verwen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Mittel an S.S. von den National Institutes of Health (R21CA170786 und R01GM127464) und der American Cancer Society (institutional research grant 74-001-34-IRG) sowie an S.S. und W.M. aus dem Valley Research Partnership Program (P1-4009 und VRP77) unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar.
Materials
| Reagent Grade Deionized Water | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet | Gibco | 12100-046 | |
| Sodium Bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Disposable PES Bottle Top Filters | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% Trypsin (10x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| Transfection medium – Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection Reagent – Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glycogen (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Size exclusion beands – Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Size exclusion mini columns | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase inactivating reagents – RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 28025013 | used for primer extension |
| Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Random Hexamers (50 µM) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Real time PCR mix – SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080093 | used for cDNA preparation |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review Material Safety Data Sheets |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review Material Safety Data Sheets |
| Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Review Material Safety Data Sheets |
| Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems | ThermoFisher Scientific |
References
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