Verbesserung der Reproduzierbarkeit, um minimale Informationen für Studien zu extrazellulären Vesikeln zu erfüllen Richtlinien 2018 in der Nanopartikel-Tracking-Analyse

Summary

Die Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) ist eine weit verbreitete Methode zur Charakterisierung extrazellulärer Vesikel. Dieses Papier hebt NTA-experimentelle Parameter und Kontrollen sowie eine einheitliche Methode zur Analyse und Charakterisierung von Proben und Verdünnungsmitteln hervor, die notwendig ist, um die von MISEV2018 und EV-TRACK vorgeschlagenen Richtlinien für die Reproduzierbarkeit zwischen Laboratorien zu ergänzen.

Abstract

Die Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) ist seit 2006 eine von mehreren Charakterisierungsmethoden, die für die extrazelluläre Vesikelforschung (EV) eingesetzt werden. Viele sind der Meinung, dass NTA-Instrumente und ihre Softwarepakete nach minimaler Schulung leicht verwendet werden können und dass die Größenkalibrierung intern möglich ist. Da sowohl die NTA-Akquisition als auch die Softwareanalyse eine EV-Charakterisierung darstellen, werden sie in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018) behandelt. Darüber hinaus wurden sie durch Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) überwacht, um die Robustheit von EV-Experimenten zu verbessern (z. B. Minimierung der experimentellen Variation aufgrund unkontrollierter Faktoren).

Trotz der Bemühungen, die Berichterstattung über Methoden und Kontrollen zu fördern, berichten viele veröffentlichte Forschungsarbeiten nicht über kritische Einstellungen, die zur Reproduktion der ursprünglichen NTA-Beobachtungen erforderlich sind. Nur wenige Artikel berichten über die NTA-Charakterisierung von Negativkontrollen oder Verdünnungsmitteln, wobei offensichtlich davon ausgegangen wird, dass kommerziell erhältliche Produkte, wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder ultrareines destilliertes Wasser, frei von Partikeln sind. In ähnlicher Weise werden Positivkontrollen oder Größenstandards selten von Forschern berichtet, um die Partikelgröße zu überprüfen. Die Stokes-Einstein-Gleichung enthält Probenviskositäts- und Temperaturvariablen, um die Partikelverschiebung zu bestimmen. Die Meldung der stabilen Laserkammertemperatur während der gesamten Probenvideoentnahme ist daher eine wesentliche Kontrollmaßnahme für eine genaue Replikation. Die Filtration von Proben oder Verdünnungsmitteln wird ebenfalls nicht routinemäßig gemeldet, und wenn ja, werden die Besonderheiten des Filters (Hersteller, Membranmaterial, Porengröße) und Lagerbedingungen selten berücksichtigt. Die Mindeststandards der International Society for Extracellular Vesicle (ISEV) für akzeptable experimentelle Details sollten ein gut dokumentiertes NTA-Protokoll für die Charakterisierung von EVs enthalten. Das folgende Experiment liefert den Nachweis, dass ein NTA-Analyseprotokoll vom einzelnen Forscher erstellt und in die Methoden von Publikationen einbezogen werden muss, die die NTA-Charakterisierung als eine der Optionen zur Erfüllung der MISEV2018-Anforderungen für die Charakterisierung einzelner Vesikel verwenden.

Introduction

Die genaue und wiederholbare Analyse von Elektrofahrzeugen und anderen nanometerskaligen Partikeln stellt Forschung und Industrie vor zahlreiche Herausforderungen. Die Replikation der EV-Forschung war schwierig, zum Teil aufgrund der mangelnden Einheitlichkeit bei der Berichterstattung über die notwendigen Parameter im Zusammenhang mit der Datenerhebung. Um diese Mängel zu beheben, schlug das ISEV Industrierichtlinien als minimale Reihe von biochemischen, biophysikalischen und funktionellen Standards für EV-Forscher vor und veröffentlichte sie als Positionspapier, das allgemein als MISEV2014^{1 bezeichnet wird}. Das beschleunigte Tempo der EV-Forschung erforderte eine aktualisierte Richtlinie, und die “MISEV2018: eine Stellungnahme des ISEV” erweiterte die MISEV2014-Richtlinien². Das MISEV2018-Papier enthielt Tabellen, Umrisse der vorgeschlagenen Protokolle und Schritte, die zu befolgen sind, um die spezifische EV-assoziierte Charakterisierung zu dokumentieren. Als weitere Maßnahme zur Erleichterung der Interpretation und Replikation von Experimenten wurde EV-TRACK als Crowdsourcing-Wissensdatenbank (http://evtrack.org) entwickelt, um eine transparentere Berichterstattung über die EV-Biologie und die für die veröffentlichten Ergebnisse verwendete Methodik^{zu ermöglichen 3}. Trotz dieser Empfehlungen für eine standardisierte Berichterstattung über Methoden leidet das Feld weiterhin unter der Replikation und Bestätigung der veröffentlichten Ergebnisse.

Passend zu den Bemühungen der National Institutes of Health und der National Science Foundation um Qualitätsbewertungsinstrumente schlägt dieses Papier vor, dass ISEV eine standardisierte Berichterstattung über Methoden und Details erfordert, damit Datenbewertungsinstrumente mit dem Ziel angewendet werden können, Ergebnisse zwischen Labors zu replizieren. Die Meldung von Zellquellen, Zellkulturverfahren und EV-Isolationsmethoden sind wichtige Faktoren, um die Qualitäten der EV-Population zu definieren. Unter den NTA-Instrumenten erschweren Faktoren wie Detektionseinstellungen, der Brechungsindex von Trägerflüssigkeit, heterogene Partikelpopulationen, die zur Polydispersität beitragen, das Fehlen standardisierter Berichtspflichten und fehlende Intra- und Inter-Beobachter-Messergebnisse den NTA-Vergleich zwischen Labors.

NTA wird seit 2006 verwendet und ist eine beliebte Methode zur Bestimmung der Größe und Konzentration von Nanopartikeln, die derzeit von etwa 80% der EV-Forscher^{verwendet wird 4}. Die MISEV2018-Richtlinien erfordern zwei Formen der Einzelvesikelanalyse, von denen NTA eine der beliebtesten Optionen ist. NTA wird aufgrund seiner breiten Zugänglichkeit, der niedrigen Kosten pro Probe und seiner einfachen Gründungstheorie (der Stokes-Einstein-Gleichung) weiterhin häufig für die EV-Charakterisierung verwendet. Die EV-Bewertung durch NTA generiert eine Partikelgrößenverteilung und -konzentrationsschätzung unter Verwendung von Laserlichtstreuung und Brownscher Bewegungsanalyse, wobei die untere Nachweisgrenze durch den Brechungsindex des EV bestimmt wird. Bei Verwendung einer Flüssigkeitsprobe mit bekannter Viskosität und Temperatur werden die Flugbahnen der EVs verfolgt, um ihre mittlere quadratische Verschiebung in zwei Dimensionen zu bestimmen. Dadurch kann der Partikeldiffusionskoeffizient berechnet und durch eine modifizierte Stokes-Einstein-Gleichung ^5,6,7 in einen kugeläquivalenten hydrodynamischen Durchmesser umgewandelt werden. Die Partikel-zu-Partikel-Analyse von NTA hat weniger Interferenzen durch Agglomerate oder größere Partikel in einer heterogenen Population von EVs als andere Charakterisierungsmethoden⁷. Während einige größere Partikel nur minimale Auswirkungen auf die Größengenauigkeit haben, führt das Vorhandensein selbst winziger Mengen großer, lichtstreuender Partikel zu einer deutlichen Verringerung der Erkennung kleinerer Partikel aufgrund der reduzierten Software-EV-Erkennung und -Verfolgung⁸. Als Messtechnik wird allgemein angenommen, dass NTA nicht auf größere Partikel oder Aggregate von Partikeln ausgerichtet ist, sondern mehrere Populationen durch individuelle Partikelanalyse auflösen^{kann 9}. Aufgrund der Verwendung der Lichtstreuung durch Partikel besteht eine der Einschränkungen der NTA-Analyse darin, dass Partikel wie Staub, Kunststoff oder Pulver mit ähnlichen Brechungs- und Größeneigenschaften im Vergleich zu Elektrofahrzeugen durch diese Charakterisierungsmethode nicht von tatsächlichen Elektrofahrzeugen unterschieden werden können.

Der NanoSight LM10 (Nanopartikelgrößenanalysator) und der LM14 (Lasermodul) werden seit 2006 verkauft, und obwohl neuere Modelle dieses Instruments entwickelt wurden, ist dieses spezielle Modell in vielen Kerneinrichtungen zu finden und gilt als zuverlässiges Arbeitstier. Es ist eine Schulung erforderlich, um die NTA-Einstellungen für hochauflösende Größen- und Konzentrationsmessungen richtig zu optimieren. Die beiden wichtigsten Einstellungen, die für optimale Videoaufnahmen benötigt werden, sind (1) die Kameraebene und (2) die Erkennungsschwelle. Diese müssen vom Bediener auf der Grundlage der Eigenschaften der Probe eingestellt werden. Eine der Haupteinschränkungen der NTA-Analyse ist die Empfehlung von Probenkonzentrationen zwischen 10 7 und 10^{9 Partikeln} / ml, um diese Probenverdünnung zu erreichen,^{kann eine 10} erforderlich sein. Lösungen, die zur Verdünnung verwendet werden, wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 0,15 M Kochsalzlösung oder Reinstwasser, sind selten frei von Partikeln mit einer Größe von weniger als 220 μm, was die NTA-Messungen beeinflussen kann. Die NTA-Charakterisierung der für die Verdünnung verwendeten Lösungen sollte auf derselben Kameraebene und Nachweisschwelle wie die analysierten Nanopartikelproben durchgeführt werden. Die Größe und Konzentration von Nanopartikeln, die in Verdünnungsmitteln enthalten sind, die für EV-Probenverdünnungen verwendet werden, werden selten in Publikationen zur NTA-Analyse von EVs erwähnt.

Dieses Protokoll verwendet die NTA-Analyse synthetischer EV-ähnlicher Liposomen, die unter Verwendung ausgewählter Kamerapegel, Erkennungsschwellen und mechanischer Filterung der Proben ausgewertet werden, um die systematischen Auswirkungen von Kamerapegel, Erkennungsschwelle oder Probenfiltration auf den NTA-Datensatz zu analysieren. Liposomen wurden wie in Supplemental File S1 beschrieben synthetisiert. Synthetische Liposomen wurden in diesem Experiment aufgrund ihrer Größengleichmäßigkeit, physikalischen Eigenschaften und Stabilität bei der Lagerung bei 4 ° C verwendet. Obwohl tatsächliche Stichproben von Elektrofahrzeugen hätten verwendet werden können, könnte die Heterogenität und Stabilität von Elektrofahrzeugen während der Speicherung diese Studie und ihre Interpretation erschwert haben. Ähnlichkeiten in den NTA-Berichten von (A) Liposomen und (B) EVs deuten darauf hin, dass die systematischen Effekte, die in diesem Artikel für Liposomen aufgedeckt wurden, wahrscheinlich auch für die EV-Charakterisierung gelten werden (Abbildung 1). Zusammengenommen unterstützen diese Ergebnisse die Vorstellung, dass die vollständige Berichterstattung über kritische Softwareeinstellungen und die Beschreibung der Probenverarbeitung wie Verdünnungsmittel, Verdünnung und Filtration die Reproduzierbarkeit von NTA-Daten beeinflussen.

Der Zweck dieses Papiers ist es, zu zeigen, dass die Variation der NTA-Einstellungen (Temperatur, Kameraniveau und Erkennungsschwelle) und der Probenvorbereitung die gesammelten Ergebnisse verändert: Es wurden systematische, signifikante Unterschiede in Größe und Konzentration erzielt. Da NTA eine der beliebtesten Optionen zur Erfüllung der MISEV2018-Charakterisierungsspezifikation ist, zeigen diese Ergebnisse, wie wichtig es ist, die Probenvorbereitung und die NTA-Einstellungen zu melden, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.

Abbildung 1: Repräsentative NTA-Berichte zum Vergleich von Liposomen mit EVs. (A) Liposomen: ungefilterte Probe, die am 12. März 2020 auf NTA charakterisiert wurde. (B) EVs: ungefilterte Probe, die am 26. August 2021 auf NTA charakterisiert wurde. Abkürzungen: NTA = Nanoparticle tracking analysis; EVs = extrazelluläre Vesikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protocol

1. Allgemeine Protokollrichtlinien Halten Sie das Mikroskop auf einem Lufttisch oder mindestens auf einem vibrationsfreien Tisch. Stellen Sie sicher, dass Fremdvibrationen (z. B. Fußklopfen auf den Boden, Berühren des Tisches, Türschließungen, Laborverkehr) auf ein Minimum reduziert werden. Stellen und halten Sie die Temperatur des Lasermoduls für alle Videoaufnahmen auf einer konstanten Temperatur.HINWEIS: Die gewählte Temperatur betrug 25 °C, da der Nanopartikelgrößenan…

Representative Results

Tabelle 1 enthält die Ergebnisse der NTA-Videos für die Liposomenproben (18 gefiltert und 18 ungefiltert) und ein repräsentatives DPBS-Verdünnungsmittel. Vergleiche zwischen den beiden Gruppen wurden unabhängig von der Kamerastufe oder dem Erkennungsschwellenwert in diesem Dokument durchgeführt. Gefilterte Proben hatten einen mittleren Partikeldurchmesser von 108,5 nm, einen Partikelmodus von 86,2 nm und eine Konzentration von 7,4 × 108 Partikeln /ml. Im Gegensatz dazu hatten ungefilter…

Discussion

Es gibt mehrere Methoden, um die Größe und Konzentration von Nanopartikeln^{abzuschätzen 11}. Dazu gehören Ensemble-Methoden, die eine Größenschätzung aus einer Population generieren, einschließlich dynamischer Lichtstreuung (DLS), zentrifugaler Sedimentation und Einzelpartikel-Level-Analyse – Elektronenmikroskopie, NTA, Rasterkraftmikroskopie und abstimmbarer resistiver Pulsmessung. Von diesen sind DLS und NTA weit verbreitete, zerstörungsfreie Größen- und Konzentrationsmessmethoden, die …

Materials

Automatic Pipetter
Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL	Thermo Sci.	339650
Kimwipes
Lens Cleaner
Lens Paper
NanoSight LM-10	Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 Laser Module	Malvern Panalytical
Nanosight NTA Software Ver. 3.2	Malvern Panalytical
Paper Towels
Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding	BioExpress	P -3243-200X
Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile	BioExpress	P-3243-1250
Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg)	Gibco	14190-144
Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)	Malvern	NTA4088
Standards, Latex Transfer- 50 nm  (3 mL)	Malvern	NTA4087
Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile	Fisher brand	09-720-004
Syringe, TB, 1 mL, slip tip	Becton Dickinson	309659
Waste fluid container