Migliorare la riproducibilità per soddisfare le informazioni minime per gli studi sulle vescicole extracellulari 2018 Linee guida nell'analisi del tracciamento delle nanoparticelle

Summary

L’analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) è un metodo ampiamente utilizzato per caratterizzare le vescicole extracellulari. Questo documento evidenzia i parametri e i controlli sperimentali NTA oltre a un metodo uniforme di analisi e caratterizzazione di campioni e diluenti necessari per integrare le linee guida proposte da MISEV2018 e EV-TRACK per la riproducibilità tra laboratori.

Abstract

L’analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) è stata uno dei numerosi metodi di caratterizzazione utilizzati per la ricerca sulle vescicole extracellulari (EV) dal 2006. Molti ritengono che gli strumenti NTA e i loro pacchetti software possano essere facilmente utilizzati seguendo una formazione minima e che la calibrazione delle dimensioni sia fattibile internamente. Poiché sia l’acquisizione di NTA che l’analisi del software costituiscono la caratterizzazione EV, sono affrontati in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018). Inoltre, sono stati monitorati da Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) per migliorare la robustezza degli esperimenti EV (ad esempio, ridurre al minimo le variazioni sperimentali dovute a fattori incontrollati).

Nonostante gli sforzi per incoraggiare la segnalazione di metodi e controlli, molti articoli di ricerca pubblicati non riportano le impostazioni critiche necessarie per riprodurre le osservazioni originali NTA. Pochi articoli riportano la caratterizzazione NTA di controlli negativi o diluenti, evidentemente assumendo che i prodotti disponibili in commercio, come la soluzione salina tamponata con fosfato o l’acqua distillata ultrapura, siano privi di particolato. Allo stesso modo, i controlli positivi o gli standard di dimensione sono raramente riportati dai ricercatori per verificare il dimensionamento delle particelle. L’equazione di Stokes-Einstein incorpora la viscosità del campione e le variabili di temperatura per determinare lo spostamento delle particelle. La segnalazione della temperatura stabile della camera laser durante l’intera raccolta video del campione è, quindi, una misura di controllo essenziale per una replica accurata. Anche la filtrazione di campioni o diluenti non viene riportata di routine e, in tal caso, le specifiche del filtro (produttore, materiale della membrana, dimensione dei pori) e le condizioni di conservazione sono raramente incluse. Gli standard minimi di dettaglio sperimentale accettabile dell’International Society for Extracellular Vesicle (ISEV) dovrebbero includere un protocollo NTA ben documentato per la caratterizzazione dei veicoli elettrici. Il seguente esperimento fornisce la prova che un protocollo di analisi NTA deve essere stabilito dal singolo ricercatore e incluso nei metodi delle pubblicazioni che utilizzano la caratterizzazione NTA come una delle opzioni per soddisfare i requisiti MISEV2018 per la caratterizzazione di singole vescicole.

Introduction

L’analisi accurata e ripetibile dei veicoli elettrici e di altre particelle su scala nanometrica presenta numerose sfide nella ricerca e nell’industria. La replica della ricerca EV è stata difficile, in parte, a causa della mancanza di uniformità nella segnalazione dei parametri necessari associati alla raccolta dei dati. Per affrontare queste carenze, l’ISEV ha proposto linee guida del settore come un insieme minimo di standard biochimici, biofisici e funzionali per i ricercatori EV e li ha pubblicati come una dichiarazione di posizione, comunemente indicata come MISEV2014¹. Il ritmo accelerato della ricerca sui veicoli elettrici ha richiesto una linea guida aggiornata e il “MISEV2018: una dichiarazione di posizione dell’ISEV” ha ampliato le linee guida MISEV2014². Il documento MISEV2018 includeva tabelle, schemi di protocolli suggeriti e passaggi da seguire per documentare la caratterizzazione specifica associata ai veicoli elettrici. Come ulteriore misura per facilitare l’interpretazione e la replica degli esperimenti, EV-TRACK è stato sviluppato come una knowledge base di crowdsourcing (http://evtrack.org) per consentire una segnalazione più trasparente della biologia dei veicoli elettrici e della metodologia utilizzata per i risultati pubblicati³. Nonostante queste raccomandazioni per la segnalazione standardizzata dei metodi, il campo continua a soffrire per quanto riguarda la replica e la conferma dei risultati pubblicati.

In linea con lo sforzo del National Institutes of Health e della National Science Foundation per gli strumenti di valutazione della qualità, questo documento suggerisce che l’ISEV richiede una segnalazione standardizzata di metodi e dettagli in modo che gli strumenti di valutazione dei dati possano essere applicati con l’obiettivo di replicare i risultati tra i laboratori. La segnalazione di sorgenti cellulari, procedure di coltura cellulare e metodi di isolamento EV sono fattori importanti per definire le qualità della popolazione EV. Tra gli strumenti NTA, fattori come le impostazioni di rilevamento, l’indice di rifrazione del fluido vettore, le popolazioni eterogenee di particelle che contribuiscono alla polidispersità, la mancanza di requisiti di segnalazione standardizzati e l’assenza di risultati di misurazione intra e inter-osservatore rendono difficile o impossibile il confronto NTA tra i laboratori.

In uso dal 2006, nta è un metodo popolare per la determinazione delle dimensioni delle nanoparticelle e della concentrazione che è attualmente utilizzato da circa l’80% dei ricercatori EV⁴. Le linee guida MISEV2018 richiedono due forme di analisi a singola vescicola, di cui NTA è una delle opzioni popolari. L’NTA continua ad essere di uso comune per la caratterizzazione dei veicoli elettrici grazie alla sua ampia accessibilità, al basso costo per campione e alla sua semplice teoria fondante (l’equazione di Stokes-Einstein). La valutazione EV da parte di NTA genera una distribuzione granulometrica e una stima della concentrazione utilizzando lo scattering della luce laser e l’analisi del movimento browniano, con il limite inferiore di rilevamento determinato dall’indice di rifrazione dell’EV. Quando si utilizza un campione fluido di viscosità e temperatura note, le traiettorie dei veicoli elettrici vengono tracciate per determinare il loro spostamento medio quadrato in due dimensioni. Ciò consente di calcolare il coefficiente di diffusione delle particelle e convertirlo in un diametro idrodinamico equivalente alla sfera da un’equazione^di Stokes-Einstein modificata ^5,6,7. L’analisi da particella a particella di NTA ha meno interferenze da parte di agglomerati o particelle più grandi in una popolazione eterogenea di veicoli elettrici rispetto ad altri metodi di caratterizzazione⁷. Mentre alcune particelle più grandi hanno un impatto minimo sulla precisione del dimensionamento, la presenza di quantità anche minime di particelle grandi e ad alta diffusione della luce si traduce in una notevole riduzione del rilevamento di particelle più piccole a causa della riduzione del rilevamento e del tracciamento^{EV del software 8}. Come tecnica di misurazione, l’NTA è generalmente considerato non prevenuto verso particelle più grandi o aggregati di particelle, ma può risolvere popolazioni di dimensioni multiple attraverso l’analisi delle singole particelle⁹. A causa dell’uso della diffusione della luce da parte delle particelle, uno dei limiti dell’analisi NTA è che qualsiasi particolato come polvere, plastica o polvere con attributi di rifrazione e dimensioni simili rispetto ai veicoli elettrici non può essere differenziato dai veicoli elettrici effettivi con questo metodo di caratterizzazione.

Il NanoSight LM10 (analizzatore di dimensioni delle nanoparticelle) e LM14 (modulo laser) sono stati venduti dal 2006 e, sebbene siano stati sviluppati modelli più recenti di questo strumento, questo particolare modello si trova in molte strutture principali ed è considerato un cavallo di battaglia affidabile. La formazione è necessaria per ottimizzare correttamente le impostazioni NTA per misurazioni ad alta risoluzione di dimensioni e concentrazione. Le due impostazioni importanti necessarie per registrazioni video ottimali sono (1) il livello della telecamera e (2) la soglia di rilevamento. Questi devono essere impostati dall’operatore in base alle caratteristiche del campione. Uno dei principali vincoli dell’analisi NTA è la raccomandazione di concentrazioni del campione tra 10⁷ e 10⁹ particelle / mL, per ottenere questa diluizione del campione può essere necessaria¹⁰. Le soluzioni utilizzate per la diluizione, come la soluzione salina tamponata con fosfato, la soluzione salina da 0,15 M o l’acqua ultrapura, sono raramente prive di particelle di dimensioni inferiori a 220 μm, il che può influire sulle misurazioni NTA. La caratterizzazione NTA delle soluzioni utilizzate per la diluizione deve essere eseguita allo stesso livello di telecamera e alla stessa soglia di rilevamento dei campioni di nanoparticelle che vengono analizzati. Le dimensioni e la concentrazione delle nanoparticelle presenti nei diluenti utilizzati per le diluizioni di campioni EV sono raramente incluse nelle pubblicazioni che coinvolgono l’analisi NTA dei veicoli elettrici.

Questo protocollo utilizza l’analisi NTA di liposomi sintetici simili a EV valutati utilizzando livelli di telecamera selezionati, soglie di rilevamento e filtraggio meccanico dei campioni per analizzare gli effetti sistematici del livello della telecamera, della soglia di rilevamento o della filtrazione del campione sul set di dati NTA. I liposomi sono stati sintetizzati come descritto nel file supplementare S1. I liposomi sintetici sono stati utilizzati in questo esperimento a causa della loro uniformità dimensionale, delle caratteristiche fisiche e della stabilità in conservazione a 4 °C. Sebbene fossero stati utilizzati campioni reali di veicoli elettrici, l’eterogeneità e la stabilità dei veicoli elettrici durante lo stoccaggio potrebbero aver complicato questo studio e la sua interpretazione. Le somiglianze nei rapporti NTA dei liposomi (A) e dei veicoli elettrici (B) indicano che gli effetti sistematici rivelati per i liposomi in questo articolo si applicheranno probabilmente anche alla caratterizzazione EV (Figura 1). Insieme, questi risultati supportano l’idea che la reportistica completa delle impostazioni critiche del software e la descrizione dell’elaborazione dei campioni, come diluente, diluizione e filtrazione, influiscano sulla riproducibilità dei dati NTA.

Lo scopo di questo documento è dimostrare che la variazione delle impostazioni NTA (temperatura, livello della telecamera e soglia di rilevamento) e la preparazione del campione cambiano i risultati raccolti: sono state ottenute differenze sistematiche e significative in termini di dimensioni e concentrazione. Poiché NTA è una delle opzioni più popolari per soddisfare le specifiche di caratterizzazione MISEV2018, questi risultati dimostrano l’importanza di riportare la preparazione del campione e le impostazioni NTA per garantire la riproducibilità.

Figura 1: Rapporti NTA rappresentativi per confrontare i liposomi con i veicoli elettrici. (A) Liposomi: campione non filtrato caratterizzato su NTA al 12 marzo 2020. (B) Veicoli elettrici: campione non filtrato caratterizzato su NTA al 26 agosto 2021. Abbreviazioni: NTA = Nanoparticle tracking analysis; EV = vescicole extracellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. Linee guida generali del protocollo Mantenere il microscopio su un tavolo d’aria o almeno su un tavolo privo di vibrazioni. Assicurarsi che le vibrazioni estranee (ad esempio, picchiettare il piede sul pavimento, toccare il tavolo, chiudere le porte, il traffico del laboratorio) siano ridotte al minimo. Impostare e mantenere la temperatura del modulo laser a una temperatura costante per tutte le registrazioni video.NOTA: la temperatura scelta è stata di 25 °C perché l’analiz…

Representative Results

La tabella 1 contiene i risultati dei video NTA per i campioni di liposomi (18 filtrati e 18 non filtrati) e un diluente DPBS rappresentativo. I confronti tra i due gruppi sono stati completati indipendentemente dal livello della telecamera o dalla soglia di rilevamento in questo documento. I campioni filtrati avevano un diametro medio delle particelle di 108,5 nm, una modalità particellare di 86,2 nm e una concentrazione di 7,4 × 108 particelle/ml. Al contrario, i campioni non filtrati avev…

Discussion

Esistono diversi metodi disponibili per stimare le dimensioni e la concentrazione delle nanoparticelle¹¹. Questi includono metodi di ensemble che generano una stima delle dimensioni da una popolazione, tra cui lo scattering dinamico della luce (DLS), la sedimentazione centrifuga e l’analisi a livello di singola particella: microscopia elettronica, NTA, microscopia a forza atomica e rilevamento di impulsi resistivi sintonizzabili. Di questi, DLS e NTA sono metodi di misurazione delle dimensioni e d…

Materials

Automatic Pipetter
Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL	Thermo Sci.	339650
Kimwipes
Lens Cleaner
Lens Paper
NanoSight LM-10	Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 Laser Module	Malvern Panalytical
Nanosight NTA Software Ver. 3.2	Malvern Panalytical
Paper Towels
Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding	BioExpress	P -3243-200X
Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile	BioExpress	P-3243-1250
Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg)	Gibco	14190-144
Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)	Malvern	NTA4088
Standards, Latex Transfer- 50 nm  (3 mL)	Malvern	NTA4087
Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile	Fisher brand	09-720-004
Syringe, TB, 1 mL, slip tip	Becton Dickinson	309659
Waste fluid container