Ex Vivo Leverperfusie door de poortader in muis
Summary
Het protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het resectie van een intacte muizenlever voor metabolische studies door middel van poortaderperfusie.
Abstract
Metabole ziekten zoals diabetes, pre-diabetes, niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) en niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) komen steeds vaker voor. Ex vivo leverperfusies maken een uitgebreide analyse van het levermetabolisme mogelijk met behulp van nucleaire magnetische resonantie (NMR), in voedingsomstandigheden die rigoureus kunnen worden gecontroleerd. Omdat silico-simulaties een voornamelijk theoretisch middel blijven om hormoonwerkingen en de effecten van farmaceutische interventie te beoordelen, blijft de geperfuseerde lever een van de meest waardevolle testbanken voor het begrijpen van het levermetabolisme. Omdat deze studies basisinzichten in de leverfysiologie begeleiden, moeten de resultaten nauwkeurig en reproduceerbaar zijn. De grootste factor in de reproduceerbaarheid van ex vivo leverperfusie is de kwaliteit van de chirurgie. Daarom hebben we een georganiseerde en gestroomlijnde methode geïntroduceerd om ex vivo leverperfusies van muizen uit te voeren in de context van in situ NMR-experimenten . We beschrijven ook een unieke toepassing en bespreken veelvoorkomende problemen die in deze onderzoeken worden aangetroffen. Het algemene doel is om een ongecompliceerde gids te bieden voor een techniek die we in de loop van meerdere jaren hebben verfijnd en die we beschouwen als de gouden standaard voor het verkrijgen van reproduceerbare resultaten in hepatische resecties en perfusies in de context van in situ NMR-experimenten. De afstand tot het midden van het veld voor de magneet en de ontoegankelijkheid van het weefsel voor interventie tijdens het NMR-experiment maakt onze methoden nieuw.
Introduction
Ex vivo perfusies zijn cruciaal in de studie van het levermetabolisme en perfusie via de poortader is de standaard voor deze studies. Om het levermetabolisme afzonderlijk te bestuderen, moet de lever uit het lichaam worden gereseceerd om complicaties als gevolg van het metabolisme in andere organen (d.w.z. het metabolisme van het hele lichaam) te voorkomen en om controle uit te oefenen over de beschikbaarheid van hormonen (insuline, glucagon, enz.). Deze aanpak kan essentieel zijn voor het begrijpen van de effecten van ziekten zoals diabetes, NAFLD en NASH op het levermetabolisme, evenals mechanismen voor de werking van geneesmiddelen. Dit artikel dient als een gids voor hepatische resectie en perfusie. We hebben een gestroomlijnde procedure ontwikkeld om deze metabole leverstudies met voldoende nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid uit te voeren. Als de operatie niet correct wordt uitgevoerd, is er een uitgesproken variabiliteit in de verkregen metabole gegevens. We beschrijven een georganiseerde methode om portaladerkatheterisatie en leverresectie uit te voeren in de context van metabole studies in situ in een kernspinresonantie (NMR) spectrometer, zoals beschreven in de literatuur 1,2,3,4,5.
Momenteel is er geen literatuur die een ex vivo leverperfusie beschrijft met behulp van een glazen kolom binnen een NMR. Evenmin is er een video- of tekstpublicatie die een duidelijk voorbeeld geeft van hoe de procedure met de lever van de muis moet worden uitgevoerd, met name door te demonstreren hoe de poortader moet worden gekatheteriseerd, een lever kan worden gereseceerd, overgedragen en de lever aan een glazen kolom kan worden opgehangen. Omdat de genetisch gemodificeerde muis alomtegenwoordig wordt gebruikt voor het bestuderen van het levermetabolisme, is dit een essentiële procedure die een volledige beschrijving verdient. Leverperfusieoperaties zijn niet nieuw, maar dit artikel is een gouden standaardmethode vergezeld van een video die de technische uitmuntendheid demonstreert die in dit artikel wordt beschreven om iedereen die geïnteresseerd is in deze procedure te helpen. De hier gepresenteerde methode zou het beste kunnen worden toegepast op real-time metabolisme om de functie en omzet van metabolieten in ziektemodellen te detecteren.
Deze methode maakt gebruik van een 100 cm wateromhulde glazen kolom, waardoor de lever aan de onderkant van de canule kan hangen, ingekapseld door perfusaat in een NMR-buis. Verwarmd water in de glazen mantel wordt gebruikt om de perfusaattemperatuur te regelen. Een dunne laag oxygenator wordt onder druk gezet met 95%/5% O2/CO2 voor pH-controle. Door gebruik te maken van drie afzonderlijke pompen wordt de perfusaatkolomhoogte ingesteld, die zorgt voor een constante druk op de lever. De stroomsnelheden worden niet geregeld na de toepassing van constante druk (figuur 1). Om te bevestigen dat de lever naar behoren functioneert, worden zuurstofmetingen uitgevoerd samen met stroomsnelheden. In onze handen leidt deze set van randvoorwaarden tot zeer herhaalbare NMR-experimenten voor de beoordeling van de leverstofwisselingsfunctie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze chirurgische ingreep is een uitdaging en vereist uitgebreide oefening om reproduceerbare resultaten te bereiken. Isofluraan en dragergas moeten indien nodig worden aangepast om de levensvatbaarheid van het dier te behouden gedurende zoveel mogelijk van de chirurgische ingreep. Omgeving, tijd van de dag, leeftijd, gewicht en verschillende andere factoren zullen de anesthesie beïnvloeden. Gewicht, dieet, muizenstam en leeftijd kunnen van invloed zijn op de operatie, omdat vetopbouw het visualiseren van de poortader k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door financiering van de National Institutes of Health (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). Een deel van dit werk werd uitgevoerd in het McKnight Brain Institute in de Advanced Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy (AMRIS) Facility van het National High Magnetic Field Laboratory, die wordt ondersteund door de National Science Foundation Cooperative Agreement No. DMR-1644779 en de staat Florida.
Materials
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4×4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
- Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State. Metabolites. 11 (7), 441 (2021).
- Lumata, L. Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs. Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).
- Moreno, K. X., et al. Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone. The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).
- Moreno, K. X., et al. Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway. NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Hwang, G. H., et al. Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).
- Bessems, M., et al. The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model. Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).
- Beal, E. W., et al. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine. The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).
- . Medical Dictionary Available from: https://www.merriam-webster.com/medical (2022)
- Thorpe, D. R. . A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep’s Brain). , (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- . Operations Manual Setup, Installation and Maintenance Available from: https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf (2006)
- . Heparin Available from: https://go.drugbank.com/drugs/DB01109 (2022)
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PloS One. 10 (2), 0117232 (2015).
